黑曲霉發酵韭菜籽產蛋白酶活力的工藝研究

孫　婕，尹國友，陶戰霞，喬少萌

（河南城建學院生命科學與工程學院，河南平頂山467036）

黑曲霉發酵韭菜籽產蛋白酶活力的工藝研究

孫婕，尹國友，陶戰霞，喬少萌

（河南城建學院生命科學與工程學院，河南平頂山467036）

為了充分利用韭菜籽中的蛋白質，本實驗研究了黑曲霉液態發酵脫脂韭菜籽粉的不同發酵條件對蛋白酶活力的影響。以發酵液中的蛋白酶活力為指標，用單因素實驗結合響應面實驗探究了初始pH、接種量、脫脂韭菜籽粉濃度和發酵時間對蛋白酶活力的影響。最佳發酵條件為：初始pH為2.95，接種量10.0%，底物濃度7.00%，發酵時間72.0h。在最佳工藝條件下蛋白酶活力可達到280U/mL。

脫脂韭菜籽，黑曲霉，液態發酵，蛋白酶

韭菜籽是百合科植物韭菜（Allium tuberosumRott. L）成熟干燥后的種子，又名韭子［1］，色黑、扁卵圓、氣辣，韭菜籽為我國傳統中藥品種，始載于《名醫別錄》，被列為中品［2］。胡國華等［3］通過大量的分析測定實驗，表明韭菜籽中含有較高含量的脂肪（15.8%）、膳食纖維（18.2%）和粗蛋白（12.3%）。韭菜籽資源在我國十分豐富，產量占世界首位，因此對韭菜籽進行產業化開發與利用顯得十分重要。

近年來蛋白酶由于其用途廣泛，商業價值高，一直是開發和研究的熱點。而微生物來源的蛋白酶具有生產周期短、生產成本低、易于管理控制、不受土地和季節限制等優點，因此，微生物蛋白酶已迅速發展成為主要的蛋白酶來源［4］。其中，黑曲霉是一種重要的工業發酵菌種。黑曲霉培養條件粗放，可產生多種活性較強的酶系，如CX酶、淀粉酶、酸性蛋白酶等［5］。在發酵過程中因為菌種的生長特性、營養條件以及蛋白酶提取等方面的影響，黑曲霉蛋白酶活力有時候比較低，因此對黑曲霉蛋白酶活特性的研究具有很大的現實意義。本實驗以脫脂韭菜籽粉為底物，采用黑曲霉液態發酵，探究黑曲霉產蛋白酶活力的最優工藝，旨為今后在工業中充分利用發酵法提取韭菜籽中生物活性物質提供相應的工藝參數。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

黑曲霉河南城建學院實驗室保存菌種（40988）；斜面培養基察氏培養基［6］；脫脂韭菜籽粉（蛋白含量31.48%）平頂山市農業科學院提供；福林酚試劑上海荔達生物科技有限公司；三氯乙酸（TCA） 天津市致遠化學試劑有限公司；無水碳酸鈉、鹽酸均為分析純，洛陽市化學試劑廠；干酪素、酪氨酸上海索萊寶生物科技有限公司。

FA1004B型電子天平、PHSJ-3F型pH計上海精密科學儀器有限公司；LDZX-C型立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫療器械廠；HZQ-C型空氣浴振蕩器哈爾濱市東明醫療儀器廠；紫外可見光分光光度計北京譜析通用儀器有限責任公司；超凈工作臺蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；HWSZ8型電熱恒溫水浴鍋上海一恒科技有限公司；FDC-1044型高速離心機科大創新股份有限公司中佳分公司。

1.2實驗方法

1.2.1實驗流程制備黑曲霉菌懸液、發酵培養基→培養基滅菌→菌懸液接種到發酵培養基中→液態發酵→離心取上清液→酶活測定。

1.2.2制備黑曲霉孢子懸液和發酵培養基取黑曲霉斜面一支，用10mL生理鹽水分兩次將菌苔洗下，充分振蕩10min后制成孢子懸液。用血球計數板在顯微鏡下直接計數［7］。用生理鹽水調整孢子懸液濃度為105個/mL即為所需孢子懸液。

發酵培養：脫脂韭菜籽粉溶液50mL/瓶，121℃滅菌20min后冷卻至室溫，按照一定比例接入孢子懸液，振蕩培養。

1.2.3酪氨酸標準曲線的制作精確稱取在105℃條件下烘至恒重的酪氨酸0.1000g，用1mol/L的鹽酸使之溶解后定容至1000mL，即為100μg/mL酪氨酸溶液。取6支試管并依次編號，分別取100μg/mL酪氨酸溶液0.00、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mL于試管中，各補充蒸餾水至1mL，接著分別加入5mL 0.4mol/L碳酸鈉溶液和1mL福林酚試劑，立即混勻，于40℃水浴保溫20min，以酪氨酸濃度為0的溶液為對照，在680nm下測定OD值。以酪氨酸的濃度（μg/mL）為橫坐標，OD值為縱坐標繪制標準曲線。在標準曲線上求得OD值為1時的酪氨酸微克數（μg），即為K值［8-10］。

1.2.4蛋白酶活力的測定采用張劍等［11］的方法，略有改動。取4支潔凈試管且編號甲、乙、丙、丁后各加入粗酶液1mL，甲管為對照。在甲試管中加入2mL 0.4mol/L TCA，使酶失活。在這4支試管中分別加入1mL 2%酪蛋白溶液，迅速混勻后立即將4支試管40℃水浴保溫10min。然后在乙、丙、丁中分別加入2mL 0.4mol/L TCA，混勻后4000r/min離心15min，除去沉淀的酶蛋白和酪蛋白，得到上清液A。取1mL上清液A，分別注入4支新試管中，各管加入5mL 0.4mol/L的碳酸鈉溶液和1mL福林酚試劑，立即混勻，40℃水浴中保溫20min。使用分光光度計測定OD680nm。蛋白酶活力計算公式如下：

其中：A—從標準曲線上查得的OD值；K—表示A=1時酪氨微克數；N—酶的稀釋倍數；4—酶活力測定中液體總體積（1mL粗酶液+1mL酪氨酸溶液+2mL TCA）；10—酶反應時間（10min）；V—測定時取酶液的體積（1mL）。

酶活力單位的定義：菌種活力的測定以酪蛋白為底物，以在40℃、pH3.6條件下，1mL粗酶液酶解酪蛋白，每分鐘產生的酪氨酸微克數為一個酶活力單位（U），單位為U/mL。

1.2.5單因素實驗設計蛋白酶活力主要受到初始pH、接種量、脫脂韭菜籽粉濃度和發酵時間的影響。因此需要通過實驗明確各個因素的影響程度［12］。

1.2.5.1初始pH對蛋白酶活力的影響稱取7%（m/v）脫脂韭菜籽粉于錐形瓶中，加入蒸餾水，調pH［13］分別為2、3、4、5、6、7后121℃條件下滅菌20min，待冷卻至室溫時加入10%（v/v）菌懸液，混勻后30℃、200r/min振蕩培養72h后發酵結束。發酵液4000r/min離心15min后取上清液，即為粗酶液。測定蛋白酶活力，考察初始pH對蛋白酶活力的影響［14］。

1.2.5.2接種量對蛋白酶活力的影響分別稱取7%（m/v）脫脂韭菜籽粉于錐形瓶中，加入蒸餾水，調pH為6.0后121℃條件下滅菌20min，待冷卻至室溫時分別加入5%、10%、15%、20%、25%（v/v）孢子懸液［15］，混勻后30℃、200r/min振蕩培養72h后發酵結束。發酵液4000r/min離心15min后取上清液，即為粗酶液。測定蛋白酶活力，考察接種量對蛋白酶活力的影響。

1.2.5.3脫脂韭菜籽粉濃度對蛋白酶活力的影響分別稱取3%、5%、7%、9%、11%（m/v）脫脂韭菜籽粉于錐形瓶中，加入蒸餾水，調pH為6.0后121℃條件下滅菌20min，待冷卻至室溫時加入15%（v/v）孢子懸液，混勻后30℃、200r/min振蕩培養72h后發酵結束。發酵液4000r/min離心15min后取上清液，即為粗酶液。測定蛋白酶活力，考察脫脂韭菜籽粉濃度對蛋白酶活力的影響。

1.2.5.4發酵時間對蛋白酶活力的影響稱取5%（m/v）脫脂韭菜籽粉于錐形瓶中，加入蒸餾水，調pH為6.0后121℃條件下滅菌20min，待冷卻至室溫時加入15%（v/v）孢子懸液，混勻后30℃、200r/min振蕩培養。發酵結束后4000r/min離心15min取上清液，即為粗酶液。每間隔24h測定蛋白酶活力，研究蛋白酶活力隨時間的變化趨勢［16］。

1.2.6響應面實驗設計在單因素實驗結果的基礎上采用四因素三水平的Box-Behnken響應面分析實驗［17-18］，以初始pH、接種量、脫脂韭菜籽粉濃度和發酵時間為自變量，以蛋白酶活力為響應值。實驗的因素和水平的取值見表1，利用Design-Expert7.1軟件程序分析各單因素對蛋白酶活力的影響，找出最佳條件。

表1　響應面分析法的因素與水平表Table 1　Factors and levels of response surface methodology

1.3數據處理

本實驗中單因素實驗數據統計及作圖均采用Excel 2003軟件，響應面分析部分運用Design-Expert軟件程序進行數據統計和作圖，所有實驗重復5次。

2　結果與分析

2.1酪氨酸標準曲線

酪氨酸標準曲線如圖1所示。酪氨酸濃度在0～50μg/mL范圍內測定OD值，R2為0.9994，線性較好。當OD680nm=1時，K=95。

圖1　酪氨酸標準曲線Fig.1　Calibration curve of tyrosine

2.2單因素對蛋白酶活力的影響

2.2.1初始pH對蛋白酶活力的影響初始pH對蛋白酶活力的影響結果如圖2所示。

圖2　初始pH對蛋白酶活力的影響Fig.2　Effect of initial pH on protease activity

由圖2可知，當pH為3時酶活力達到最大值即464U/mL，pH在3～5范圍內，酶活力大幅度降低，pH在5～7范圍內酶活力降低的較緩慢。從微生物適宜生長環境來看，培養基初始pH對酶的合成有重大影響，因為pH會影響到細胞膜所帶的電荷，引起細胞對營養物質吸收狀況的變化，對細胞施加間接影響，改變某些化合物分子進入細胞的狀況，從而促進或抑制微生物的生長［19］。綜上所述，選擇初始pH3為最佳的發酵條件。

2.2.2接種量對蛋白酶活力的影響接種量對蛋白酶活力的影響結果如圖3所示。

由圖3可知，接種量對黑曲霉發酵脫脂韭菜籽粉產蛋白酶的活力有著重要的影響。過小或過大的接種量均不利于發酵產酶。當接種量較小時（低于10%），前期菌體生長過慢，使發酵周期延長，產酶較少，酶活力較低；隨著接種量的增大，酶活力也隨之增大，當接種量為10%時，酶活達到最大值，即144U/mL。接種量較高時（高于10%），初期菌體生長迅速，營養物多用于細胞合成，使酶合成下降，酶活力逐漸降低［20］；再從經濟方面考慮，接種量過大，增加成本。因此，最終確定接種量10%為最佳條件。

2.2.3脫脂韭菜籽粉濃度對蛋白酶活力的影響脫脂韭菜籽粉濃度對蛋白酶活力的影響結果如圖4所示。

圖3　接種量對蛋白酶活力的影響Fig.3　Effect of inoculation concentration on protease activity

圖4　脫脂韭菜籽粉濃度對蛋白酶活力的影響Fig.4　Effect of defatted leek seeds concentration on protease activity

由圖4可知，隨著脫脂韭菜籽粉濃度的增大，蛋白酶活力也隨之增加，當脫脂韭菜籽粉濃度為7%時，酶活力達到最大，即186U/mL。從微生物的生長特點來看，黑曲霉是好氧真菌，當脫脂韭菜籽粉濃度較小時，培養基中的營養物質少，不利于黑曲霉生長和產酶；當脫脂韭菜籽粉濃度增大時，酶活反而下降。這可能是由于脫脂韭菜籽粉含豐富的蛋白質，當其濃度過高時會造成的氮源過多的環境，使菌體生長過旺盛，黑曲霉生長產生的粘性物質使培養基黏度增大，容易導致溶氧不足，不利于水解酶類的積累，從而導致酶活下降［21］。因此，脫脂韭菜籽粉濃度為7%時是最佳的發酵條件。

2.2.4發酵時間對蛋白酶活力的影響發酵時間對蛋白酶活力的影響結果如圖5所示。

由圖5可知，前72h酶活力隨發酵時間增加而增加，在發酵72h時酶活力達到最大，即384U/mL；發酵72h后酶活力下降。從黑曲霉生長規律來看，在開始階段黑曲霉處于生長延滯期，生長較慢，酶活力較低；隨著時間的延長黑曲霉大量繁殖，消耗底物的速度加快，產酶較多從而使酶活力增大；發酵后期，黑曲霉開始衰亡，產酶能力下降，酶活力也隨之逐漸降低［22］。綜上所述，發酵72h是最佳的發酵條件。

2.3響應面法優化結果和分析

2.3.1回歸模型的優化根據單因素實驗結果，采用響應面分析法進行設計，對初始pH（A），接種量（B），脫脂韭菜籽粉濃度（C），發酵時間（D）4因素3水平共27個實驗點（3個中心點）的響應面分析實驗，運用Design-Expert軟件程序對實驗點的響應值進行回歸分析。Box-Behnken實驗設計和結果以及回歸方程的方差分析結果見表2。

用Design-Expert 7.1軟件，對表2中的數據進行多元回歸擬合，可得回歸方程為：

R1=+2.94-0.076A+0.034B+0.0005C-0.027D+ 0.065AB+0.070AC-0.0007AD-0.060BD-0.048CD-0.80A2-0.35B2-0.37C2-0.38D2

對回歸方程進行方差分析，結果見表3。

圖5　發酵時間對蛋白酶活力的影響Fig.5　Effect of fermentation time on protease activity

表2　Box-Behnken設計方案及響應值結果Table 2　Experiment design and results of response surface methodology

表3　回歸方程的分析Table 3　Analysis of the established regression mode

由表3回歸模型方差分析結果可知，模型的F值為170.6，p＜0.0001，表明模型極顯著。回歸方程的相關系數R2=0.9950，說明回歸方程的擬合程度良好。模型調整確定系數R2Adj=0.9892，說明模型能解釋98.92%響應值的變化，擬合程度較好。失擬項不顯著（p＞0.05）說明數據中沒有異常點，不需要引入更高次數的項，模型適當，能很好地對響應值進行預測。由表3和圖6可以看出，一次項A及二次項A2、B2、C2、D2表現為極顯著（p≤0.01），一次項B、D及交互項AB、AC、BD、CD表現為顯著（p＜0.05），表明所考察因素對響應值的影響不是簡單的的線性關系，曲面效應顯著。影響蛋白酶活力的因素由大到小的順序為：初始pH＞接種量＞發酵時間＞脫脂韭菜籽粉濃度。

響應面圖形是響應值對應于實驗因素A（初始pH）、B（接種量）、C（脫脂韭菜籽粉濃度）、D（發酵時間）所構成的三維空間的曲面圖，它可直觀反映各因素及它們之間的交互作用對響應值的影響。將一個因素固定在零水平，利用Design-Expert軟件即可作出另外兩因素交互作用的響應曲圖。兩因素及其交互作用響應面圖如圖6所示。

圖6　兩因素及其交互作用響應面圖

2.3.2最佳實驗條件確定通過Design-Expert軟件分析，可得最佳的發酵條件為：初始pH2.95，接種量為10.1%，脫脂韭菜籽粉濃度為7.00%，發酵時間為72.0h。在此條件下，蛋白酶活力的理論值可達294U/mL。

為了驗證實驗結果是否與真實情況一致，從實際考慮對模型預測結果進行修正后最佳的發酵條件為：初始pH為2.95，接種量為10.0%，脫脂韭菜籽粉濃度為7.00%，發酵時間為72.0h。在此條件下進行3次平行實驗，得到蛋白酶活力為280U/mL。實際值與預測值非常接近，說明優化結果可靠。

3　結論

根據單因素的實驗結果，通過Box-Behnken中心組合實驗設計及響應面分析，得到具有很好擬合度的回歸方程模型，該模型具有統計學意義，從而確定優化條件。最終的優化條件為：初始pH為2.95，接種量為10.0%，脫脂韭菜籽粉濃度為7.00%，發酵時間為72.0h，在此條件下蛋白酶活力可達到280U/mL。

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Study on the process of protease production by Aspergillus niger on leek seeds

SUN Jie，YIN Guo-you，TAO Zhan-xia，QIAO Shao-meng
（College of Life Science and Engineering，Henan University of Urban Construction，Pingdingshan 467036，China）

In order to take full of advantage of leek seeds protein，this paper studied the effects of different fermentation conditions on the protease activity of Aspergillus niger in defatted leek seeds.According to the index of the protease activity in the fermented liquid，this experiment explored the effects of initial pH，inoculum size，substrate concentration and fermentation time on protease activity using single factor experiment and response surface methodology（RSM）.The optimum process conditions were as follows：initial pH 2.95，inoculum size 10.0%，substrate concentration 7.00%and fermentation time 72.0h.Under this optional conditions，the protease activity reached 280U/mL.

defatted leek seeds；Aspergillus niger；liquid-state fermentation；protease activity

TS201.1

A

1002-0306（2015）14-0098-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.010

2014－10－20

孫婕（1976-），女，博士，副教授，研究方向：天然產物分離純化及功能性質研究。

河南省科技計劃重點科技攻關項目（132102210192）；河南省教育廳科學技術重點研究項目（14A550003）；與平頂山市農業科學院合作項目（20121220）。