大麻素2型受體在尋常性銀屑病皮損組織中的表達

楊競 黎兆軍

大麻素2型受體在尋常性銀屑病皮損組織中的表達

楊競 黎兆軍

目的 探討大麻素2型受體在尋常性銀屑病皮損組織中的表達及其意義。方法 實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）、免疫組化技術檢測20例尋常性銀屑病患者皮損組織及皮損周圍組織、10例非銀屑病患者的正常皮膚組織中大麻素2型受體在mRNA和蛋白不同水平的表達情況。結果 尋常性銀屑病皮損組織、皮損周圍組織及正常皮膚中均有大麻素2型受體mRNA表達，尋常性銀屑病組表達明顯高于皮損周圍組及正常對照組（P＜0.05）；三組皮損組織均有大麻素2型受體蛋白表達，且尋常性銀屑病組表達明顯高于皮損周圍組、正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 尋常性銀屑病皮損組織中大麻素2型受體在基因及蛋白水平表達均升高，提示大麻素2型受體可能與尋常性銀屑病的發生發展有關聯。

銀屑病；基因；受體，大麻酚，2

大麻素受體（cannabinoid receptor，CNR）為 G蛋白耦聯受體，廣泛分布于神經系統和各種組織器官，包括CNR1和CNR2亞型。皮膚中CNR參與細胞增殖分化、免疫調節、感覺傳導、腫瘤發生等生理與病理過程，主要表達CNR2。尋常性銀屑病為一種慢性炎癥性紅斑鱗屑性皮膚病，較常見，易復發，與角質形成細胞增殖關系密切。我們采用實時熒光定量PCR（RT-PCR）和免疫組化法檢測CNR2在mRNA和蛋白水平的表達情況，探討CNR2在尋常性銀屑病皮損表達分布差異的變化。

作者單位：524000廣東湛江，廣東醫學院附屬醫院皮膚性病研究所

一、對象

2013年10月至2014年8月，在廣東醫學院附屬醫院皮膚科經臨床及病理證實的尋常性銀屑病患者20例，其中男12例，女8例。納入標準為銀屑病面積和嚴重程度指數（PASI）≥10及皮損面積＞10%的中、重度進展期尋常性銀屑病患者。所有患者取材前1個月內未接受過系統治療，2周內未外用銀屑病治療藥物，排除嚴重感染和患有紅斑狼瘡、天皰瘡、皮肌炎等自身免疫性皮膚病患者，合并肝、腎及其他嚴重疾病患者以及懷孕、哺乳期婦女。非銀屑病患者10例的正常皮膚標本（色素痣、皮膚纖維瘤、皮贅等皮膚良性腫瘤周圍皮膚），其中男6例，女4例，均排除銀屑病和其他自身免疫性皮膚病，并經組織病理學證實為正常皮膚。上述標本均取自軀干部。本實驗經廣東醫學院附屬醫院倫理委員會審批通過，所有患者均簽署知情同意書。

二、方法

1.標本處理：尋常性銀屑病患者皮損斑塊，沿皮紋走向行梭形切口（長1 cm，寬0.5 cm），梭形皮損長端一側（約1/2面積）為尋常性銀屑病病變組織，另一側為病變周圍正常組織。將標本分3部分，即切取梭形皮損長端兩側各約50 mg組織，分別放入標記好的凍存管立即液氮速凍，-80℃冰箱保存，用于RT-PCR檢測；剩余中間部分（包含尋常性銀屑病病變組織和病變周圍正常組織）用4%甲醛固定，常規石蠟包埋，用于免疫組化。正常皮膚標本分兩部分，一部分（約50 mg）液氮速凍，-80℃冰箱保存，其余部分用4%甲醛固定，常規石蠟包埋。

2.主要試劑：CNR2兔抗人多克隆抗體為英國Abcam公司產品；通用型羊抗兔抗體、3,3-二氨基聯苯胺（DAB）酶底物顯色試劑盒為福建邁新生物技術有限公司產品；RT-PCR試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產品。

3.RT-PCR：凍存組織研磨后用Trnzol-A+一步法提取總RNA；紫外分光光度計測定RNA濃度和純度。RNA經逆轉錄生成cDNA后，進行實時熒光定量PCR檢測。本實驗選用兩管反應體系對目的基因和內參照進行擴增，建立總體積為20 μl的逆轉錄反應體系。取2 μl cDNA進行PCR擴增。擴增條件：94℃預變性 30 s，95℃ 變性 5 s，58℃退火 34 s，60℃延伸1 min，共進行40個循環，循環結束后60℃延伸10 min，4℃保存。引物序列設計如下：CNR2上游5′-GACCGCCATTG ACCGATAC-3′，下游 5′-AGTGCTGAGAGGACCCACAT-3′（111bp）；β肌動蛋白上游5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′，下游5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′（285 bp）。RT-PCR反應結束后，LightCycler480ⅡDNA擴增儀自動分析并計算Ct值，以 2-ΔΔCt為該目的基因 mRNA 的相對模板量，2-ΔΔCt＞ 1表示目的基因表達上調，反之下調。

4.免疫組化：石蠟標本切片脫蠟水化；0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）高溫高壓修復2 min，室溫自然冷卻；3%H2O2室溫避光孵育10 min；滴加CNR2一抗，4℃濕盒孵育過夜；次日，再滴加二抗，室溫孵育30 min后DAB顯色，蘇木素復染細胞核，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。上述各步驟之間均以磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3次。每次實驗均設立一個陰性對照，即PBS代替一抗，其余步驟相同，陰性對照DAB不能使其顯色。所有組織染色條件相同。

5.免疫組化染色結果判定：光鏡下觀察，表現為棕黃色顆粒即CNR2表達陽性，著色強度高于背景非特異性染色。由兩位有經驗的病理科醫生采用雙盲法觀察每張切片，隨機選取 5個不重疊的高倍鏡視野（×400），參照 Salvesen等［1］的標準，按染色強度和陽性細胞所占比例進行半定量測定。按染色強度評分：無著色計0分，淡黃色（弱）計1分，淺棕色（中）計2分，深棕色（強）計3分；按陽性細胞所占比例評分：＜5%計 0分，5% ～25%計 1分，26% ～50%計 2分，51% ～75%計3分，＞75%計4分，兩種評分相加，≤3分判為陰性（-），＞3分判為陽性（+）。

6.統計學分析：采用SPSS 17.0軟件進行統計學處理，ΔCt值以±s表示。對尋常性銀屑病和正常皮膚組織目的基因的ΔCt值進行獨立樣本t檢驗，CNR2蛋白表達陽性率比較用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 正常皮膚組織、尋常性銀屑病皮損及周圍正常皮膚中CNR2 mRNA表達情況比較（±s）

表1 正常皮膚組織、尋常性銀屑病皮損及周圍正常皮膚中CNR2 mRNA表達情況比較（±s）

注：P值為與正常皮膚組織比較

組織 例數 ΔCt 2-ΔΔCt正常皮膚 10 6.89±1.16 1.00 t值 P值銀屑病皮損 20 4.86±0.97 3.975.089 ＜0.05銀屑病周圍正常皮膚 20 6.29±1.02 1.491.479 ＞0.05

圖1 正常皮膚組織CNR2主要位于表皮基底層胞質，呈淺棕色（免疫組化×200）

圖2 尋常性銀屑病皮損CNR2彌漫分布于棘細胞層，胞質呈深棕色（免疫組化×200）

圖3 尋常性銀屑病皮損周圍正常組織CNR2主要位于基底層，胞質呈淺棕色（免疫組化×200）

三、結果

1.總RNA純度檢測：紫外分光光度計測定RNA濃度和純度，光密度A260/A280均在1.8～2.2之間，說明RNA無降解，質量較好，符合實驗要求；熔解曲線未見雜峰，說明擴增產物單一，無非特異性擴增；擴增曲線可見所有樣品均進入擴增平臺期，說明反應條件設定準確。

2.CNR2mRNA表達情況：見表1。尋常性銀屑病皮損組織mRNA 表達強度（2-ΔΔCt=3.97）明顯高于正常組織（2-ΔΔCt=1），差異有統計學意義（t=5.089，P=0.000）；尋常性銀屑病皮損組織表達高于皮損周圍組織，差異亦有統計學意義（t=4.530，P=0.001）；而皮損周圍組與正常對照組間差異無統計學意義（t=1.479，P=0.150）。

3.免疫組化染色觀察：正常皮膚中CNR2染色主要位于表皮層的基底細胞層（圖1），真皮毛囊和汗腺也有表達，表明本實驗所用抗CNR2抗體可特異性識別CNR2。在尋常性銀屑病皮損中CNR2染色陽性細胞彌漫分布于表皮層的棘細胞層（圖2），真皮毛囊和汗腺亦有表達。而CNR2在病變周圍組織亦表達于表皮層的基底細胞層（圖3），與正常對照組表達相近。

4.CNR2蛋白表達情況：CNR2在尋常性銀屑病皮損組織中表達的陽性率為90%（18/20），高于皮損周圍組（15%，3/20，χ2=22.56，P＜ 0.01）和正常對照組（10%，χ2=18.37，P＜0.01），而正常對照組與皮損周圍組比較，χ2=0.14，P=0.70。

四、討論

內源性大麻素系統（endocannabinoid system，ECS）由內源性大麻素、G蛋白耦聯的CNR、激活它們的大麻素衍生物及其相關的生物化學體系（前體細胞、合成和降解酶類、載體）組成。現有研究顯示，通過調節ECS，可以影響人體各種生理病理過程，并可作為眾多疾病的潛在治療手段，涉及領域包括免疫、炎癥、神經退行性變及胃腸道、肝臟、心血管疾病等，其中CNR作為ECS的重要組成部分起著關鍵作用［2］。近年發現，ECS參與皮膚細胞增殖、存活和分化的調控，是維持皮膚穩態的關鍵決定因素。Petrosino等［3］已證實，在皮膚角質形成細胞中存在ECS的目標因子N花生四烯酰乙醇胺。Dobrosi等［4］在人類和小鼠皮膚細胞中觀察到大量CNR2調節介導的免疫反應，包括皮膚神經纖維細胞、肥大細胞、角質形成細胞和皮膚附屬器細胞。人黑素瘤和黑素瘤細胞株均表達 CNR2［5］。趙梓綱等［6］研究證實，CNR2 在皮膚惡性黑素瘤、皮膚鱗狀細胞癌等皮膚腫瘤的表達明顯增強。實驗表明［7］，CNR的激活可抑制腫瘤的生長、增生、血管形成和轉移，促進腫瘤的凋亡。

本實驗表明，CNR2在尋常性銀屑病皮損、皮損周圍皮膚和正常對照組中均有表達，尋常性銀屑病皮損為過度表達，與正常對照組間差異有統計學意義（P＜0.05），但皮損周圍皮膚與正常對照組間無明顯差異（P＞0.05）。提示CNR2與尋常性銀屑病發病存在一定關聯。研究表明，ECS中的大麻素有抗炎和抑制角質形成細胞增殖的功能，而這些功能是通過調節CNR完成的，CNR激動劑可開發作為銀屑病治療的藥物之一［8］。在小鼠模型IgE誘導的皮膚過敏反應中，合成的非選擇性CNR激動劑及其衍生物表現出明顯的抗炎活性［9］。CNR2可能通過抑制增生、減少細胞因子和趨化因子生成、誘導輔助型T細胞以及促凋亡等途徑介導免疫抑制，進而發揮保護作用［10］。因此，尋常性銀屑病皮損組織CNR2的過度表達，是表皮棘細胞層肥厚增生的協同表現，亦或是機體為抑制角質形成細胞增殖而顯示的自我保護反應，但具體作用機制仍待研究。

綜上所述，CNR2在進展期尋常性銀屑病皮損組織中表達明顯增強，CNR2在尋常性銀屑病發生發展過程中可能發揮重要作用，為進一步闡明銀屑病發病機制及臨床治療提供新思路。但在CNR2發揮作用的同時，是否有大麻素1型受體或其他相關蛋白參與，及在銀屑病不同分型和尋常性銀屑病不同分期皮損組織中是否有類似表達，仍需深入研究。

［1］Salvesen HB,Stefansson I,Kalvenes MB,et al.Loss of PTEN expression is associated with metastatic disease in patients with endometrial carcinoma［J］.Cancer,2002,94（8）:2185-2191.

［2］Klein TW,Newton C,Larsen K,et al.The cannabinoid system and immune modulation［J］.J Leukoc Biol,2003,74（4）:486-496.

［3］Petrosino S,Cristino L,Karsak M,et al.Protective role of palmitoylethanolamide in contact allergic dermatitis［J］.Allergy,2010,65（6）:698-711.

［4］Dobrosi N,Tóth BI,Nagy G,et al.Endocannabinoids enhance lipid synthesis and apoptosis of human sebocytes via cannabinoid receptor-2-mediated signaling［J］.FASEB J,2008,22（10）:3685-3695.

［5］Blázquez C,Carracedo A,Barrado L,et al.Cannabinoid receptors as novel targets for the treatment of melanoma［J］.FASEB J,2006,20（14）:2633-2635.

［6］趙梓綱,楊潔,李園園,等.大麻素2型受體在皮膚惡性黑素瘤中的表達［J］.中華皮膚科雜志,2009,42（8）:572-574.

［7］Sarfaraz S,Afaq F,Adhami VM,et al.Cannabinoid receptor as a novel target for the treatment of prostate cancer［J］.Cancer Res,2005,65（5）:1635-1641.

［8］Wilkinson JD,Williamson EM.Cannabinoids inhibit human keratinocyte proliferation through a non-CB1/CB2 mechanism and have a potential therapeutic value in the treatment of psoriasis［J］.J Dermatol Sci,2007,45（2）:87-92.

［9］Dalle Carbonare M,Del Giudice E,Stecca A,et al.A saturated N-acylethanolamine other than N-palmitoyl ethanolamine with antiinflammatory properties:a neglected story［J］.J Neuroendocrinol,2008,20（Suppl 1）:26-34.

［10］Rieder SA,Chauhan A,Singh U,et al.Cannabinoid-induced apoptosis in immune cells as a pathway to immunosuppression［J］.Immunobiology,2010,215（8）:598-605.

《中國皮膚科學史》出版暨籌建“中國皮膚科博物館”啟事

一、《中國皮膚科學史》2014年出版發行。該書由陳洪鐸、廖萬清、張學軍策劃，馬振友、張建中、鄭懷林主編，國內外200余名知名專家共同編輯完成，文圖并茂，史料翔實，是大型皮膚科史書。定價800元。

二、籌建集皮膚科史、科研、教學、書庫于一體的“中國皮膚科博物館”。這是一項功在當代、利在千秋的系統工程。為保護中國皮膚科珍貴文物，特向全國征集皮膚科文獻、儀器、器械、教具、蠟模、影像等文物，對捐獻、聯展的人士將贈送《中國皮膚科學史》，對重大貢獻者勒石記功。

三、郵購《皮膚美容化妝品制劑手冊》二版（78元），《國際皮膚病分類與名稱》（766元），《最新皮膚科藥物手冊》（88元）。舉辦全國皮膚美容化妝品制劑班。

四、發布皮膚科、美容原料藥、圖書郵購信息，資料備索。轉讓馬振友發明的生發和養發外用藥國家專利（201210387061.9）。聯系單位及人員：馬振友皮膚病研究所馬振友、蘇榮彪，QQ386966727；手機13379033002；電話：029-62682729，4000981899，0435-4222180。

Expression of cannabinoid receptor type 2 in skin lesions of psoriasis vulgaris

Yang Jing,Li Zhaojun.
Institute of Dermatology and Venereology,Affiliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang 524000,Guangdong,China Corresponding author:Li Zhaojun,Email:skindoctor@163.com

Objective To investigate the expression of cannabinoid receptor type 2 （CNR2）in skin lesions of psoriasis vulgaris,and to explore its significance.Methods Tissue samples were obtained from lesions and perilesional skin of 20 patients with psoriasis vulgaris,and normal skin of 10 human controls without psoriasis or other autoimmune dermatoses.Real-time fluorescence-based quantitative PCR and immunohistochemistry were performed to determine the mRNA and protein expression levels of CNR2 in these samples.Statistical analysis was carried out by using two-samplet test and chi-square test.Results CNR2 mRNA and protein were expressed in the normal control skin,lesional skin and perilesional skin tissues.As immunohistochemistry showed,CNR2 was distributed diffusedly in the prickle cell layer in lesional skin,but expressed in the basal cell layer of the epidermis in normal control skin and perilesional skin.The mRNA expression level（2-△△Ct）of CNR2 was significantly higher in lesional skin than in normal control skin and perilesional skin tissues（3.97 vs.1.00 and 1.49,bothP＜0.05）,but similar between normal control skin and perilesional skin tissues（P＞0.05）.The expression rate of CNR2 protein was significantly higher in lesional skin（90%（18/20）than in perilesional skin（15%（3/20）,χ2=22.56,P ＜ 0.01）and normal control skin tissues（10%（2/20）,χ2=18.37,P ＜ 0.01）,while there was no significant difference between normal control skin and perilesional skin tissues（χ2=0.14,P=0.70）.Conclusions The mRNA and protein expressions of CNR2 are both increased in skin lesions of psoriasis vulgaris,suggesting that CNR2 may be related to the occurrence and development of psoriasis vulgaris.

Psoriasis;Genes;Receptors,cannabinoid,2

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.07.015

湛江市非資助科技攻關計劃項目（2014B01084）

黎兆軍，Email：skindoctor@163.com

2014-09-15）

（本文編輯：吳曉初）