中波紫外線誘導的提前衰老成纖維細胞上清液對人真皮成纖維細胞增殖、老化及自噬的影響

王申 周炳榮 駱丹 張家安 劉娟 張麗超 易飛 吳紅巾 栗丹 胡燕燕

中波紫外線誘導的提前衰老成纖維細胞上清液對人真皮成纖維細胞增殖、老化及自噬的影響

王申 周炳榮 駱丹 張家安 劉娟 張麗超 易飛 吳紅巾 栗丹 胡燕燕

目的 觀察中波紫外線誘導的提前衰老的成纖維細胞條件培養液對人真皮成纖維細胞增殖、老化及自噬的影響。方法 取健康青少年男子環切術后包皮進行人真皮成纖維細胞的分離培養。將中波紫外線誘導的提前衰老的成纖維細胞條件培養液培養成纖維細胞設為實驗組，并設立對照組即正常成纖維細胞條件培養液培養成纖維細胞。處理20 d后，用CCK8法檢測細胞增殖活性，EDU（5-乙炔基-2，脫氧尿嘧啶核苷）法檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞周期，β半乳糖苷酶染色計算衰老細胞百分比，吖啶橙染色檢測細胞自噬，Western印跡法及間接免疫熒光檢測自噬相關蛋白LC3-B的表達水平。數據采用Graphpad Prism 5軟件分析，兩組間比較采用成組t檢驗。結果 實驗組成纖維細胞增殖活力（0.831±0.017）明顯低于對照組（0.973±0.017），但EDU染色及流式細胞儀檢測結果均顯示，實驗組S期細胞百分比明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。β半乳糖苷酶染色顯示，實驗組成纖維細胞陽性率（25.710%±0.304%）高于對照組（5.257%±1.023%），差異有統計學意義（t=19.170，P＜0.05）。吖啶橙染色結果顯示，實驗組成纖維細胞紅色熒光量（14.287±2.269）低于對照組（29.614±2.650）。Western印跡及間接免疫熒光結果均顯示，實驗組成纖維細胞LC3-B表達量明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論 中波紫外線誘導的提前衰老成纖維細胞的條件培養液可降低成纖維細胞的自噬及增殖，并加速其老化。

紫外線；成纖維細胞；細胞衰老；自噬；細胞增殖

作者單位：210029南京醫科大學第一附屬醫院皮膚科

體外培養的正常細胞經過紫外線照射［1］等應激刺激，能引起細胞出現提早衰老，稱為應激誘導的提前衰老。近年來研究表明，經紫外線照射的、自然老化的、藥物誘導的及腫瘤誘導的老化成纖維細胞均可分泌可溶性物質至培養液中，使周圍成纖維細胞發生諸如增殖活性降低、DNA損傷、周期阻滯等生物學表現［2-3］。然而，對于提前衰老的成纖維細胞能否通過旁觀者效應影響其周圍正常成纖維細胞尚未見報道。我們已證明中波紫外線（UVB）誘導的提前衰老成纖維細胞條件培養液可對人真皮成纖維細胞造成氧化損害［4］。本研究用UVB誘導的提前衰老成纖維細胞條件培養液作用于正常人真皮成纖維細胞，觀察其對后者增殖、老化及自噬的影響。

材料與方法

一、細胞來源、試劑和儀器

人皮膚成纖維細胞來自南京醫科大學第一附屬醫院泌尿外科手術室健康青少年男子環切術后包皮。細胞計數試劑盒8（簡稱CCK8）、β半乳糖苷酶染色試劑盒、BCA試劑盒、間接免疫熒光封閉液、FITC標記山羊抗小鼠IgG（H+L）（上海碧云天生物技術有限公司）；EDU（5-乙炔基-2，脫氧尿嘧啶核苷）細胞增殖檢測試劑盒（廣州市銳博生物科技有限公司）；吖啶橙試劑盒（美國Sigma公司）；小鼠抗人LC3-B抗體（美國Cell Signaling公司）。SS-04P型UVB臺式紫外線光療儀及UVB輻照度監示器（上海希格瑪高技術有限公司）。

二、方法

1.細胞分離和培養：將包皮修剪去皮下組織，剪成小皮片后加入0.5%分散酶消化液，4℃下消化18～20 h；分離表、真皮；取真皮部分以膠原酶消化液37℃消化2 h后，200目尼龍網過濾、1 300×g離心5 min，棄培養液，加入含10%胎牛血清及1%青鏈霉素的培養基（dulbecco′s modified eagle medium，DMEM），混勻并轉移至培養皿中，于37℃、5%CO2飽和濕度細胞培養箱中培養。將處于亞融合狀態對數生長期細胞以0.02%乙二胺四乙酸和0.25%胰酶消化傳代，取4～10代細胞進行實驗。

2.UVB誘導提前衰老的成纖維細胞：用含10%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM培養基將成纖維細胞稀釋成1×105個/ml，每孔10 ml接種于10 cm培養皿，繼續培養至40%融合時開始進行UVB照射。UVB照射前用磷酸鹽緩沖液（PBS）替換培養基，照射后換含1%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM培養基繼續培養。連續培養5 d，每日同一時間照射1次UVB，每次劑量為10mJ/cm2，總劑量為50mJ/cm2，第5次照射后，將培養基換為含10%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM，靜置3 d后即可獲得UVB誘導的提前衰老的成纖維細胞。

3.正常成纖維細胞及提前衰老的成纖維細胞條件培養液的收集和細胞處理：分別將UVB誘導的提前衰老的成纖維細胞及正常成纖維細胞用含10%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM培養基稀釋成1×105個/ml，每孔10 ml接種于10 cm培養皿，繼續培養至70%融合時重新換含10%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM培養基繼續培養2～3 d后收集培養液。將培養液1 300×g離心5 min去除細胞碎片，用0.22 μm濾器過濾后放入-80℃冰箱中備用，用時均與新鮮培養基以1∶1混合。將成纖維細胞以1×105個/ml接種于75 cm2大培養瓶中，分為實驗組即UVB誘導的提前衰老的成纖維細胞條件培養液培養成纖維細胞、對照組即正常成纖維細胞條件培養液培養成纖維細胞。待細胞融合70%時，各組加入相應培養液，連續培養20 d。

4.CCK8法檢測細胞增殖活性：將上述處理后的細胞以2×103個/孔的密度重新接種于96孔板中，待細胞貼壁后，棄去原培養液，每孔加10 μl CCK8溶液及90 μl培養液。37℃繼續孵育1 h后，用酶標測定儀在450 nm處測吸光度（A值）。

5.EDU法檢測細胞增殖：將上述處理后的細胞以2×105個/ml細胞接種于小培養皿中，待細胞貼壁后，棄去原培養液，PBS漂洗1遍，每孔加入50μmol/L的EDU培養基500 μl，37℃孵育2 h后，棄培養基。每孔加入含4%多聚甲醛的PBS 500 μl室溫固定30 min，棄固定液；加入 2 g/L 甘氨酸 500 μl，并加入含0.5%TritonX-100的PBS 500 μl破膜，然后加入1 × Apollo?染色反應液 100 μl，避光、室溫、脫色搖床孵育30 min后，棄染色反應液；加入含0.5%TritonX-100 的 PBS 500 μl破膜，棄滲透劑；每孔每次加入100 μl甲醇清洗1～2次，每次5 min；PBS清洗1次，每次5 min。最后加入100×Hoechst33342反應液500 μl，避光、室溫、脫色搖床孵育30 min后，棄染色反應液；PBS清洗3次，置熒光顯微鏡下觀察。

6.流式細胞儀檢測細胞周期：將上述處理好的細胞用胰酶消化，1 300×g離心5 min后收集細胞，400μl75%預冷乙醇固定24 h，振蕩器振蕩10 min使細胞團塊與乙醇充分混合。再次1300×g離心5min后，棄培養液，加入50 mg/L碘化丙錠和50 mg/L RNA酶，避光室溫30min，流式細胞儀檢測細胞周期。

7.細胞β半乳糖苷酶染色檢測細胞提前衰老：將上述處理好的細胞以2×105個/ml接種于小培養皿中，待細胞貼壁后，棄去原培養液，PBS洗滌1次，按照試劑盒說明書依次加入染色固定液室溫固定15 min，PBS洗滌3次，加入染色工作液，37℃孵育過夜。陽性細胞的胞質被染成深藍色，光鏡下觀察染色結果并進行陽性細胞計數（每皿至少計數200個細胞并計算陽性細胞所占百分比）。

8.吖啶橙染色：將處理好的細胞以2×105個/ml接種于共聚焦培養皿中，待細胞貼壁后，棄去原培養液，PBS漂洗3遍，加終質量濃度為1 mg/L的吖啶橙避光作用2 min，棄染液，用PBS洗滌3遍，每遍避光作用10 min，在熒光顯微鏡下觀察。

9.間接免疫熒光：將處理好的細胞以2×105個/ml接種于共聚焦培養皿中，待細胞貼壁后，棄去原培養液，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min，棄固定液，加入免疫熒光封閉液封閉1 h，棄封閉液，加入1∶200稀釋的LC3-B一抗4℃孵育過夜，棄染液，加入1∶200稀釋的相應二抗避光室溫孵育2 h，加入DAPI室溫避光孵育20 min，棄DAPI，PBS漂洗后在倒置激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察并熒光定量。

10.Western印跡：將處理好的兩組細胞以1×105個/ml接種于10 cm培養皿，繼續培養至90%融合，提取各組細胞總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，轉移至硝酸纖維素膜，室溫封閉2 h，與LC3-B特異性抗體及相應二抗作用后，經ECL化學發光法顯色，凝膠圖像分析系統分析蛋白表達，以β肌動蛋白的表達做內參。

圖1 EDU染色檢測UVB誘導的提前衰老成纖維細胞條件培養液對成纖維細胞增殖活性的影響（熒光顯微鏡×100，紅色細胞代表處于S期的細胞） 1A：對照組；1B：實驗組。實驗組S期細胞數目多于對照組

圖2 β半乳糖苷酶染色檢測UVB誘導的提前衰老成纖維細胞條件培養液對成纖維細胞提前衰老的影響（熒光顯微鏡×100，藍綠色細胞代表衰老細胞） 2A：對照組；2B：實驗組。實驗組成纖維細胞染色陽性率明顯高于對照組

結 果

一、UVB誘導的提前衰老成纖維細胞條件培養液對成纖維細胞增殖的影響

CCK8結果顯示，實驗組細胞增殖活性（A值為0.831±0.017）明顯低于對照組（0.973±0.017），差異有統計學意義（t=5.850，P＜0.05）。EDU染色結果顯示（圖 1），實驗組S期細胞百分比（28.483%±0.964%）明顯高于對照組（18.461%±0.580%），差異有統計學意義（t=8.904，P＜0.05）。流式細胞儀檢測細胞周期結果顯示，實驗組S期細胞百分比（16.510%±1.114%）高于對照組（9.593%±0.188%），差異也有統計學意義（t=6.127，P＜ 0.05）。

二、UVB誘導的提前衰老成纖維細胞條件培養液對成纖維細胞提前衰老的影響

β半乳糖苷酶染色檢測顯示（圖2），實驗組成纖維細胞染色陽性率（25.710%±0.304%）明顯高于對照組（5.257%±1.023%），差異有統計學意義（t=19.170，P＜ 0.05）。

三、UVB誘導的提前衰老成纖維細胞條件培養液對成纖維細胞自噬的影響

正常細胞經吖啶橙染色后，在熒光顯微鏡下可見綠色及暗紅色熒光，當細胞自噬水平降低時，紅色熒光減弱。對照組的紅色熒光定量（29.614±2.650）明顯高于實驗組（14.287± 2.269），差異有統計學意義（t=4.390，P＜0.05）。間接免疫熒光結果表明，實驗組成纖維細胞LC3-B表達量（10.133±0.212）明顯低于對照組（17.241± 0.207），差異有統計學意義（t=23.970，P＜0.05）。見圖3。Western印跡結果顯示，對照組的LC3-B/LC3-A（1.544±0.011）明顯高于實驗組（0.540±0.004），差異有統計學意義（t=87.403，P＜0.05）。見圖 4。

圖3 激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察UVB誘導的提前衰老成纖維細胞條件培養液對LC3-B表達的影響（間接免疫熒光染色×200） 綠色熒光代表LC3-B表達量，綠色熒光越強，LC3-B表達量越高，自噬越強。實驗組成纖維細胞LC3-B的表達量明顯低于對照組

討 論

皮膚老化包括內源性老化和外源性老化，前者由基因決定，后者由煙霧、紅外線、營養不良、空氣污染、紫外線等引起，其中紫外線的影響最大［5］，是皮膚老化的重要機制。人真皮成纖維細胞可通過產生基質、糖化蛋白、黏附因子和多種細胞因子等，維持皮膚的完整性和修復細胞外基質，是光老化過程中的關鍵細胞［6］。郭嫻菲等［7］證明，選擇 UVB 每日10 mJ/cm2連續5 d照射成纖維細胞，可成功誘導提前衰老的成纖維細胞。本研究使用相同方法誘導建立成纖維細胞提前衰老模型，且在預實驗時已通過β半乳糖苷酶染色法證明成纖維細胞已衰老。

圖4 Western印跡法觀察UVB誘導的提前衰老成纖維細胞條件培養液對成纖維細胞LC3-B表達的影響 實驗組與對照組相比，LC3-A的表達量不變，LC3-B的表達量明顯降低

Widel等［3，8］提出紫外線輻射誘導的旁觀者效應可能是一種普遍存在的現象。目前多個研究發現，受單次紫外線輻射的細胞分泌低分子量化學因子，這些化學因子影響了未受輻照的附近細胞，從而產生旁觀者效應［3］。另有理論［2，8-9］認為，受單次紫外線輻射的細胞、自然老化的細胞分泌的小分子通過“縫隙連接”作用于鄰近細胞，產生旁觀者效應，這些小分子物質可以使鄰近細胞發生與原細胞類似的變化，如增殖減緩、老化加劇等，表明紫外線輻射及自然老化的細胞均可通過直接作用和旁觀者作用損害人類健康。Widel等［3，8］證明，接受單次紫外線輻射的成纖維細胞可通過產生氧自由基，使成纖維細胞DNA損傷，從而使成纖維細胞增殖減緩，并將成纖維細胞阻滯在G1期。本研究證明，UVB誘導的提前衰老成纖維細胞條件上清液可使成纖維細胞的增殖減緩。本研究中實驗組成纖維細胞G1期細胞百分比較對照組低，S期細胞百分數明顯高于對照組，且進一步行EDU細胞增殖實驗顯示，實驗組成纖維細胞的S期細胞百分比要高于對照組。以上結果表明，UVB誘導的提前衰老成纖維細胞條件上清液可以抑制成纖維細胞的增殖，并將細胞阻滯在S期。

蔡霞等［10］證明，正常人成纖維細胞在體外培養過程中，β半乳糖苷酶的表達在老化細胞中顯著增強，且這種增強與細胞衰老表型的出現和細胞增殖能力的喪失相平行，可反映細胞的老化程度。本研究中，實驗組β半乳糖甘酶染色陽性率明顯高于對照組，說明UVB誘導的提前衰老成纖維細胞條件上清液可促進成纖維細胞提前衰老。張青松等［11］證明，UVB誘導的人皮膚成纖維細胞光老化模型中成纖維細胞提前衰老程度越高，增殖越慢，自噬越低。

自噬是細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質的過程，是真核細胞特有的生命現象［12］。本實驗采用間接免疫熒光和Western印跡法檢測自噬體膜上標志性蛋白質，即微管相關蛋白1的輕鏈3（LC3），以及用吖啶橙染色法觀察自噬細胞。LC3定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，參與自噬體的形成。LC3有LC3-A與LC3-B，未發生自噬時，細胞內合成的LC3經過加工，成為胞質可溶性LC3-A，常規表達。當自體吞噬發生時，LC3-A經泛素樣加工修飾過程，與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結合，形成LC3-B。LC3-B結合并始終位于胞內自噬體的膜上，LC3-B/LC3-A比值與自噬泡數量的多少成正比［13-14］。自噬體和溶酶體融合后，可以使用吖啶橙染色法，吖啶橙在自噬溶酶體內酸性磷酸酶活性增強下顯著著色，紅色熒光量與自噬成正比［15］。本實驗中實驗組吖啶橙染色紅色熒光強度低于對照組，實驗組的LC3-B的表達量及LC3-B/LC3-A的比值亦顯著低于對照組，表明提前衰老的成纖維細胞條件上清液使LC3-A向LC3-B轉化減少，使細胞自噬泡數量減少及細胞清除衰老或損傷的細胞器等的能力明顯下降，從而使細胞自噬能力明顯減少，不利于細胞內穩態的維持。

綜上所述，本實驗證明，UVB誘導的提前衰老成纖維細胞條件上清液可以抑制成纖維細胞的增殖，使其阻滯在S期，促進其提前衰老，并使其自噬減少，但其具體機制尚需進一步探討。

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Effects of conditioned medium of prematurely senescent fibroblasts induced by ultraviolet B on cellular proliferation,aging and autophagy of human dermal fibroblasts

Wang Shen,Zhou Bingrong,Luo Dan,Zhang Jia′an,Liu Juan,Zhang Lichao,Yi Fei,Wu Hongjin,Li Dan,Hu Yanyan.
Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China

s:Luo Dan,Email:daniluo2013@njmu.edu.cn;Zhou Bingrong,Email:bingrong.2002@163.com

Objective To investigate the effects of conditioned medium of prematurely senescent fibroblasts induced by ultraviolet B（UVB）on the proliferation,aging and autophagy of human dermal fibroblasts.Methods Human dermal fibroblasts were isolated from the circumcised foreskin of healthy adolescent males,and subjected to primary culture.Premature senescence was induced in some fibroblasts by UVB radiation at 10 mJ/cm2once daily for 5 consecutive days.Some fibroblasts were classified into two groups:an experimental group cultured in conditioned medium of UVB-induced prematurely senescent fibroblasts,and a control group cultured in conditioned medium of normal fibroblasts.After treatment for 20 consecutive days,cell counting kit-8 （CCK8）assay and 5-ethynyl-2′.-deoxyuridine（EDU）staining were performed to evaluate cellular proliferation,flow cytometry was conducted to estimate cell cycle,βgalactosidase staining to determine the percentage of senescent cells,accridine orange staining to detect the autophagy level,and Western blot and indirect immunofluorescence assay were carried out to determine the expression level of the autophagy-related protein LC3-B.Statistical analysis was done by using a two-samplettest with the Graphpad Prism 5 software.Results Compared with the control group,the proliferative activity of fibroblasts was significantly decreased（0.831±0.017 vs.0.973±0.017,t=5.850,P＜0.05）,while EDU staining and flow cytometry both showed a significant increase in the percentage of S-phase cells（bothP ＜ 0.05）,in the experimental group.The percentage of β-galactosidasepositive fibroblasts was significantly higher in the experimental group than in the control group（25.710%±0.304%vs.5.257% ±1.023%,t=19.170,P＜0.05）.Accridine orange staining revealed that the red fluorescence intensity of fibroblasts was significantly lower（14.287±2.269 vs.29.614±2.650,t=4.390,P＜0.05）,while Western blot and indirect immunofluorescence assay both showed a significant elevation in the expression level of LC3-B （bothP＜0.05）,in the experimental group compared with the control group.ConclusionsThe conditioned medium of prematurely senescent fibroblasts induced by UVB can downregulate autophagy and proliferation of fibroblasts,butaccelerate their aging.

Ultraviolet rays;Fibroblasts;Cell aging;Autophagy;Cell proliferation

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.07.011

國家自然科學基金（81371757、81301384、81000700）

駱丹，Email：daniluo2013@njmu.edu.cn；周炳榮，Email：bingrong.2002@163.com

2014-09-05）

（本文編輯：周良佳 顏艷）