地黃多糖干預對低劑量X線照射小鼠生精細胞P53和bcl-2蛋白表達的影響*

仵春云 趙昌濤 張杜平 唐開發 邢俊平**

1. 西安交通大學醫學院第一附屬醫院預防保健科（西安 710061）；

2. 西安交通大學醫學院第一附屬醫院泌尿外科； 3. 貴陽醫學院附屬醫院泌尿外科

地黃多糖干預對低劑量X線照射小鼠生精細胞P53和bcl-2蛋白表達的影響*

仵春云1趙昌濤2張杜平2唐開發3邢俊平2**

1. 西安交通大學醫學院第一附屬醫院預防保健科（西安 710061）；

2. 西安交通大學醫學院第一附屬醫院泌尿外科； 3. 貴陽醫學院附屬醫院泌尿外科

目的 探討地黃多糖干預對低劑量X線照射損傷小鼠生精細胞中p53和bcl-2蛋白水平表達的影響。方法選擇70只雄性昆明小鼠（5～6周齡；體重22±2g），隨機分為：單純照射組（1～3組），給藥照射組（4～9組）和正常對照組（10組）。所有小鼠自照射前5d開始每天灌胃一次，分別給予0.2mL生理鹽水灌胃（1～3組和10組）和地黃多糖（溶于0.2mL生理鹽水）200mg/Kg（4～6組）、800mg/Kg（7～9組），共24次。照射組自第6天起采用X線每天一次全身照射，共15次；單次照射劑量分別為0.025、0.075、0.100Gy，劑量率為0.025Gy/min。所有小鼠在末次照射結束后48小時內脫頸法處死摘取睪丸，經Bouin氏液固定24h后石蠟包埋、切片。采用HE染色觀察睪丸生精小管形態結構，免疫組織化學法檢測生精細胞中P53及bcl-2蛋白的表達水平。結果 隨著單次低劑量X線照射劑量增加，HE染色可見照射組小鼠睪丸生精小管各級生精細胞數目逐漸減少，結構排列出現不同程度的紊亂；免疫組織化學可見生精細胞中p53蛋白表達水平逐漸增加，而bcl-2蛋白表達水平則逐漸下降。給予200mg/Kg及800mg/Kg地黃多糖灌胃能下調生精細胞中p53蛋白和上調bcl-2蛋白表達水平，但后者對p53及bcl-2蛋白表達水平調節作用更明顯，兩者具有顯著統計學意義（P＜0.05）。結論 地黃多糖對低劑量X線全身照射小鼠的損傷生殖功能有一定保護作用，其抗輻射作用機制部分可能與下調生精細胞中p53蛋白、上調bcl-2蛋白表達水平有關。

輻射劑量； 地黃； 生精上皮

輻射源在醫療、衛生、能源、航天科技等行業的應用越來越廣泛，其所產生的低劑量輻射已成為重要的環境污染之一［1］。尋找藥效顯著、毒副作用小且成本低廉的抗輻射藥物成為新的研究熱點。地黃多糖作為地黃的主要組成成分，具有增強免疫、抗氧化、抗衰老及抗腫瘤等作用［2，3］。本研究旨在采用不同低劑量X線全身照射小鼠構建生殖功能損傷動物模型的基礎上，給予不同濃度的地黃多糖水溶液灌胃，通過觀察小鼠睪丸生精細胞中P53和bcl-2蛋白水平表達的變化，探討地黃多糖對低劑量X線照射損傷小鼠生殖功能的保護作用，為地黃多糖進一步的開發利用提供參考。

材料與方法

一、材料

（一）實驗動物

5～6周齡清潔型健康雄性昆明小白鼠70只，體重（22±2）g，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供［合格證號：SCXX（陜）2007-001］。自由攝食進水，室溫20℃～24℃，普通顆粒飼料喂養，由西安交通大學醫學院實驗動物中心專人飼養。

（二）主要試劑與儀器

兔抗小鼠P53多克隆抗體（FL-393）（ZYMED公司）；兔抗小鼠bcl-2多克隆抗體（ZM-0010）（ZYMED公司）；抗體稀釋液（ZLI-9028）（中山金橋生物技術有限公司）；即用型免疫組化染色試劑盒（SP-9000）（中杉金橋生物技術有限公司）；濃縮型DAB試劑盒（ZLI-9031）（中杉金橋生物技術有限公司，北京）；地黃提取物地黃多糖由西安斯諾特生物技術有限公司提供，地黃多糖含量65%，符合95版藥典；Bouin氏液（本實驗室自行配制）；真色彩圖象分析儀（Q570C，Leica，德國）

二、方法

（一）動物分組

將70只雄性昆明小鼠完全隨機均分成3大組10小組：即單純照射組（1～3組），地黃多糖給藥照射組（4～9組），正常對照組（10組）。

（二）給藥及照射造模方法

所有小鼠自照射前5d開始每天灌胃一次，分別給予0.2mL生理鹽水灌胃（1～3組和10組）和地黃多糖（溶于0.2mL生理鹽水）200mg/Kg（4～6組）、800mg/Kg（7～9組），共24次。照射組自第6天起采用X線每天一次全身照射，共15次；單次照射劑量分別為0.025、0.075、0.100Gy，劑量率為0.025Gy/min。

（三）標本收集及制備

末次照射結束后48h內將所有小鼠稱重，10%水合氯醛麻醉，無菌條件下解剖，切開陰囊暴露雙側睪丸，去除睪丸周圍脂肪，生理鹽水洗去血絲，脫頸椎法處死小鼠。在睪丸白膜多處用針頭輕輕扎20～30個小孔，用Bouin氏液固定6h后，用清潔刀片將睪丸沿短軸方向從中間切成兩塊或三塊，繼續固定18h。常規酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后切片（厚度約4mm），貼于3-氨丙基-3-甲氧基硅烷（APES）及多聚賴氨酸處理過的載玻片上，37℃烘箱烘干備用。

（四）睪丸組織形態學觀察

室溫下，模擬海水浸泡時間對無涂層和有涂層Q235碳鋼腐蝕速率的影響如圖8所示.由圖8可知，無涂層Q235碳鋼樣品的初始腐蝕速率約為0.1 g/(m2·h),6天后腐蝕速率降為0.05 g/(m2·h).有涂層Q235碳鋼樣品的初始腐蝕速率為-0.35 g/(m2·h)，出現負值可能是因為涂層吸水增重導致.隨著時間延長，有涂層樣品的腐蝕速率逐漸增大，也就是說涂層的吸水速率逐漸變小.在34天的室溫浸泡過程中有涂層樣品的腐蝕速率都是負值，表明涂層沒有因腐蝕而失重.這和圖7所顯現的現象一致，說明所制備的涂層有較好的抗室溫海水腐蝕性能.

石蠟包埋切片常規HE染色，OlymPus BX51顯微鏡下觀察比較睪丸組織學形態和各組間的變化，Image-Pro軟件拍照記錄。

（五）睪丸生精細胞P53與bcl-2蛋白表達水平免疫組化檢測

按免疫組化試劑盒提供的SP法進行免疫組化染色：石蠟標本脫蠟后，梯度酒精脫水，0.01M pH6.0檸檬酸鹽緩沖液中進行高壓抗原修復，以3%的H2O2于濕盒中室溫下孵育10min阻斷內源性過氧化物酶活性，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育15min，加入1：100稀釋的兔抗小鼠bcl-2一抗50μL，置于濕盒中4℃冰箱內過夜。37℃水浴復溫30min，滴加50μL生物素化山羊抗兔二抗工作液IgG，37℃孵育15min，再加入50ul辣根酶標記鏈霉卵白素工作液（HRP），于37℃孵育15min。經DAB顯色，蘇木素復染，封片。細胞核棕黃色或棕褐色為陽性，陰性細胞胞核呈藍色或僅顯示細胞輪廓。采用圖像分析儀采集圖像，記錄陽性生殖細胞數，并計算其百分比。

三、統計學分析

采用SPSS17.0進行數據錄入和統計分析，實驗所得數據以均數±標準差表示。兩組間數據比較采用t檢驗，如存在方差不齊，行秩和檢驗后有統計學意義；多重比較采用秩變換結合完全隨機設計的方差分析，P＜0.05有統計學意義。

結 果

一、小鼠睪丸組織形態學變化

（一）低劑量X線照射對睪丸組織形態的影響

不同低劑量X線照射后睪丸生精小管結構疏松程度不一，生精上皮細胞層有不同程度的減少，內層生精細胞減少，且出現排列紊亂，管腔內成熟精子數明顯減少，其中0.100Gy劑量組最明顯，如圖1所示。

給予200mg/Kg的RPS水溶液灌胃不同低劑量X線照射后可見X線照射后各組的睪丸組織形態變化較小，主要為生精細胞數目減少，結構稍顯紊亂，其中0.100Gy劑量組改變較為明顯，如圖2所示。

圖1 不同低劑量X線單純照射小鼠睪丸形態學（HE×400）A: 空白對照； B: 0.025Gy照射組； C: 0.075Gy照射組； D: 0.100Gy照射組

圖2 200mg/Kg地黃多糖灌胃不同低劑量X線照射小鼠睪丸組織學形態學（HE×400）A: 空白對照； B: 0.025Gy照射組； C: 0.075Gy照射組； D: 0.100Gy照射組

（三）800mg/Kg RPS灌胃后低劑量X線照射對睪丸組織形態影響

如圖3所示，生精小管結構未見紊亂改變，生精細胞無減少。

二、小鼠睪丸組織中p53與bcl-2蛋白表達水平

（一）不同低劑量X線照射對p53與bcl-2蛋白表達的影響

正常對照組小鼠睪丸精原細胞及精母細胞中可見少量P53陽性細胞，隨著單次低劑量X線照射劑量（0.025、0.075、0.100Gy）增加P53陽性細胞增多，見表1，圖4。相反，正常對照組小鼠精母細胞、精子細胞及精子中有大量bcl-2陽性細胞，隨著單次低劑量X線照射劑量增加（0.025、0.075、0.100Gy）bcl-2陽性細胞減少，見表1，圖5。

圖3 800mg/Kg地黃多糖灌胃不同低劑量X線照射小鼠睪丸組織學形態學（HE×400）A: 空白對照； B: 0.025Gy照射組； C: 0.075Gy照射組； D: 0.100Gy照射組

圖4 單純照射后生精細胞中P53蛋白在不同X線劑量組的表達水平（SP×400）A: 空白對照； B: 0.025Gy照射組； C: 0.075Gy照射組； D: 0.100Gy照射組

圖5 單純照射后生精細胞中bcl-2蛋白在不同X線劑量組的表達水平（SP×400）A: 空白對照； B: 0.025Gy照射組； C: 0.075Gy照射組； D: 0.100Gy照射組

表1 不同低劑量X線照射后生精細胞中P53/bcl-2蛋白的陽性表達率（%）

（二）200mg/Kg RPS灌胃后低劑量X線照射對P53與bcl-2蛋白表達的影響

照射前給予小鼠200mg/KgRPS灌胃，在不同低劑量（0.025、0.075、0.100Gy）X線照射后，生精細胞中P53蛋白表達陽性率隨著照射劑量的增加而升高，而bcl-2蛋白表達陽性率隨照射劑量增加下降，其中在0.075Gy照射時下降較明顯，見表2。

表2 生精細胞中P53與bcl-2蛋白在200mg/Kg地黃多糖灌胃時的陽性表達率（%）

（三）800mg/KgRPS灌胃后低劑量X線照射對P53與bcl-2蛋白表達的影響

照射前給予小鼠800mg/KgRPS灌胃，在不同低劑量（0.025、0.075、0.100Gy）X線照射后，生精細胞中P53蛋白表達陽性率隨著照射劑量的增加逐漸升高，但增加幅度較單純照射時明顯變小，而bcl-2蛋白表達陽性率隨照射劑量增加而下降，在0.075Gy時下降較明顯，見表3。

表3 生精細胞中P53與bcl-2蛋白在800mg/Kg地黃多糖灌胃時的陽性表達率（%）

討 論

近年來，隨著輻射源在電子產品、醫療等領域的應用增多，其產生的低劑量輻射對人體健康的危害已引起人們的重視。我們前期的研究也顯示多次低劑量X線照射可使小鼠睪丸重量及睪/體比值下降、引起小鼠睪丸組織病理改變，從而誘導凋亡、影響精子DNA完整性，且具有劑量效應［4］。本研究表明在多次低劑量X線全身照射小鼠的同時，給予不同濃度的地黃多糖水溶液灌胃，可以有效地降低電離輻射引起的睪丸組織學及生精細胞損害，從而起到良好的保護作用，而且在800mg/Kg劑量時效果更好。進一步的免疫組化研究表明給予不同濃度的地黃多糖水溶液灌胃后能下調生精細胞中p53蛋白和上調bcl-2蛋白表達水平，并且這種對p53及bcl-2蛋白表達水平調節作用呈劑量依賴性。

p53和bcl-2基因在輻射所致的生精細胞凋亡機制中起著重要作用。p53作為電離輻射誘導細胞凋亡的重要基因，在輻射損傷的修復和誘導凋亡中具有重要的調控作用，倍受國內外研究者的重視［5，6］。p53被稱為細胞的“守門者”，主要功能是監視細胞的生長、增殖、分化，DNA損傷修復以及促進細胞凋亡等［7］。P53在G1期監視細胞基因組DNA完整性，如果DNA受損傷，p53蛋白就使細胞停留在G1期，修復后再進入M期；如果損傷不能修復，則誘發其凋亡。Bcl-2為重要的抑凋亡基因，可以通過抑制P53等的作用，發揮對細胞凋亡的抑制功能［8，9］。因此，本研究所觀察到結果提示地黃多糖干預可減輕多次低劑量X線照射后小鼠生精功能的損傷，其機制可能部分通過下調生精細胞中p53蛋白和上調bcl-2蛋白表達水平來實現。然而，地黃多糖也可能通過其他途徑抑制輻射所致的生殖損傷，這有待今后進一步研究。

1 Redpath JL， Lu Q， Lao X， et al. Low doses of diagnostic energy X-rays protect against neoplastic transformation in vitro. Int J Radiat Biol 2003； 79（4）: 235-240

2 崔瑛， 顏正華，侯士良，等. 地黃多糖藥理研究進展.中國自然醫學雜志 2000； 2（3）: 186-188

3 王玉華， 王偉. 地黃多糖的研究概況. 上海中醫藥雜志2007； 41（5）: 81-83

4 仵春云， 唐開發， 張杜平， 等. 多次低劑量X線照射對小鼠睪丸組織形態及生精細胞P53和bcl-2蛋白表達的影響. 中國男科學雜志 2013； 27（1）: 17-19， 22

5 She QB， Chen N， Dong Z. ERKs and P38 kinase phosphorylate p53 protein at serine 15 in response to UV radiation. J Biol Chem 2000； 275（27）: 20444-20449

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7 錢鑫， 朱應葆. DNA放射損傷與p53. 生理科學進展2005； 36（4）: 379-381

8 Nguyen M， Branton PE， Walton PA， et al. Role of membrane anchor domain of bcl-2 in suppression of apoptosis caused by E1B-defective adenovirus. J Biol Chem 1994； 269（24）: 16521-16524

9 劉光偉， 童麗華， 王珍琦， 等. 低劑量電離輻射對小鼠睪丸生精細胞P53和BCL-2蛋白表達的影響. 吉林大學學報?醫學版 2004； 30（1）: 85-88

（2015-07-10收稿）

Effects of Rehmannia Glutinosa Polysaccharide on the expressions of P53 and bcl-2 protein in mouse germ cells exposed to repeated low-dose X-ray irradiation*

Wu Chunyun1， Zhao Changtao2， Zhang Duping2， Tang Kaifa3， Xing Junping2**
1.Department of Sanitation and Antiepidemic， The First Affi liated Hospital，Xi’an Jiaotong University， School of Medicine，Xi'an 710061， China； 2. Department of Urology，The First Affi liated Hospital，Xi'an Jiaotong University， School of Medicine；3.The Affi liated Hospital of Guiyang Medical College
Corresponding author: Xing Junping， E-mail: xingjpsx@sina.cn

Objective To explore the effects of Rehmannia Glutinosa Polysaccharide on the expressions of P53 and bcl-2 protein in mouse germ cells exposed to repeated low-dose X-ray irradiation. Methods Total of 70 male mice （5-6 weeks old； weight 22 ± 2g） were selected in this study and randomly divided into four groups such as group A （irradiation group， 21 mice）， group B （radiation and 200mg/Kg RPS fed group， 21 mice） ， group C （radiation and 800mg/Kg RPS fed group， 21 mice）， group D （the control group， 7 mice）； and then mice in group A， B and C were subdivided into 3 groups and each group had 7 mice. On 5th day before irradiation， the mice in groups A and D were intragastrically administrated with 0.2mL saline， and mice in group B and group C were intragastrically given with 200mg/Kg， 800mg/Kg Rehmannia Glutinosa Polysaccharide which were dissolved in 0.2mL saline. Intragastrical administration was performed for a total of 24times. The mice in group A， B and C

low-dose whole body X-irradiation for 15 times； The single irradiation doses were 0.025， 0.075 and 0.100Gy with dose rate 0.025Gy/min. Mice were sacrifi ced in 48 hours after the last irradiation， their testes were removed and fixed in Bouin's solution for 24 hours， then embedded in paraffin and sliced. The morphology of testicular seminiferous tubules was observed and the expressions of P53 and bcl-2 protein in germ cells were detected by immunohistochemistry. Results With the increasing single dose of X-ray irradiation， HE staining showed that the number of germ cells in the testis of the mice in the irradiation group was decreased， and the disorder of the structural arrangement appeared in different degrees. The immunohistochemical analysis showed that the protein level of P53 gradually increased while the bcl-2 protein level decreased in spermatogenic cells gradually. Both 200mg / kg and 800mg/Kg Rehmannia glutinosa polysaccharides Given orally can downregulate the expression of p53 protein and upregulate the expression of bcl-2 protein in germ cells， but it is more remarkable in the group of 800mg/Kg Rehmannia glutinosa polysaccharides ， and there was a statistical differences （P＜0.05）. Conclusion Rehmannia glutinosa Polysaccharide shows a protective effect for the reproductive function of mice with X-irradiation damage， which may be related to downregulation of P53 protein， and upregulation of of bcl-2 protein in spermatogenic cells.

radiation dosage； rehmannia glutinosa； seminiferous epithelium

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.11.002

R 358.4

資助: 陜西省科技計劃項目（編號：2008K-15）

**通訊作者， E-mail: xingjpsx@sina.cn