茶多酚對高尿酸血癥小鼠尿酸水平的影響及機制研究

譚明亮，陳　　剛，3，*

（1.重慶工商大學天然藥物研究重點實驗室，重慶400067；2.重慶工商大學催化與功能分子重慶市重點實驗室，重慶400067；3.重慶工商大學環境與生物工程學院，重慶400067）

茶多酚對高尿酸血癥小鼠尿酸水平的影響及機制研究

譚明亮1，2，陳剛1，2，3，*

（1.重慶工商大學天然藥物研究重點實驗室，重慶400067；2.重慶工商大學催化與功能分子重慶市重點實驗室，重慶400067；3.重慶工商大學環境與生物工程學院，重慶400067）

為探討茶多酚對氧嗪酸鉀誘導的小鼠高尿酸血癥的影響及機制，以制備氧嗪酸鉀誘導的小鼠高尿酸血癥模型，連續給予灌胃150、300、600mg/kg茶多酚7d，磷鎢酸法檢測小鼠血清尿酸含量，化學比色法檢測小鼠血清及肝臟中的黃嘌呤氧化酶活性。結果表明：在茶多酚灌胃300、600mg/kg劑量下與模型組相比高尿酸血癥模型小鼠血清中尿酸的含量減少22%及29%（均p＜0.01），與此同時，血清中黃嘌呤氧化酶的活性顯著降低14%（p＜0.05）及21%（p＜0.01），且肝臟中黃嘌呤氧化酶的活性也顯著降低16%（p＜0.05）及21%（p＜0.01）。因此茶多酚可顯著降低高尿酸血癥模型小鼠的血尿酸水平，且其作用機制與抑制黃嘌呤氧化酶的活性密切相關。

茶多酚，高尿酸血癥，黃嘌呤氧化酶，尿酸

高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）是由于體內嘌呤代謝異常導致血尿酸水平超出正常范圍的一種機體狀態。大量研究證實，HUA與動脈粥樣硬化、胰島素抵抗、高血壓等疾病的發生、發展密切相關［1-2］。機體內尿酸的生成增加或排泄減少是導致高尿酸血癥的重要病因，因此降低尿酸生成過程中的關鍵催化酶——黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）的活性或增加腎臟中尿酸的排泄成為研發抗高尿酸血癥藥物的主要切入點。別嘌醇作為目前我國臨床使用治療高尿酸血癥的一線藥物，其作用機制主要為抑制XOD的活性而減少尿酸的生成［3］。雖然別嘌醇對于高尿酸血癥的療效確切，但是其具有嚴重的副作用，包括發熱、過敏性皮疹、白細胞及血小板減少，甚至肝功能損害［4］。因此尋找替代或增效的藥物顯得尤為迫切。

茶多酚（green tea polyphenols，GTP）是從茶葉中提取的一類以兒茶素為主體的酚類化合物總稱。主要包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、咖啡堿（caffeine，CAF）、表兒茶素（epicatechin，EC）及兒茶素（Catechin，C）［5］。已有報道發現GTP具有抗氧化、清除自由基、降低血糖、抗動脈粥樣硬化、抗炎和抑菌等活性［6-7］，但GTP對HUA的影響及機制尚待明確。

本研究通過建立氧嗪酸鉀（potassium oxonate，PO）誘導的小鼠HUA模型，觀察GTP對小鼠HUA血尿酸水平的影響，并從調節HUA小鼠血清及肝臟中XOD活性的途徑探討其作用機制。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

SPF級昆明種小鼠雄性，體重18～22g購自重慶醫科大學實驗動物中心（動物合格證號：SCXK（渝）2002-0001）；市售茶葉永川秀芽（產品標準：Q/ YLC0002S，生產許可：QS508314010005）；茶多酚各成分標準品、PO均購自Sigma公司；別嘌醇購自重慶青陽藥業有限公司（批號：120903，國藥準字：H50021422）；乙酸乙酯、氯仿（分析純） 均購自成都市科龍化工試劑廠；磷酸、乙腈（色譜純） 均購自美國TEDIA公司；尿酸試劑盒、黃嘌呤氧化酶測試盒、考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

Mill-iQ型純水系統美國Millipore公司；RC24型高速冷凍離心機美國Thermo Scientific Sorvall公司；Infinite M200型酶標儀瑞士TECAN公司，SIR-50 IVC系統上海邵豐實驗動物設備有限公司；Agilent 1100高效液相色譜儀美國Hewlett Packard公司；Supelco Discovery RP酰胺C16色譜柱（150mm× 4.6mm，5μm） 美國Supelco公司。

1.2實驗方法

1.2.1茶多酚的制備及檢測按照Wang［5］的方法，稱取綠茶100g，加1L雙蒸水提取3次，每次沸騰30min，將提取液收集并過濾、濃縮，濃縮液用1.5倍的氯仿萃取4次，取水相，用1.5倍的乙酸乙酯萃取水相4次，取乙酸乙酯相，旋轉蒸發器蒸干得干燥樣品，其提取率為15.6%（w/w）。

取1g茶葉提取物，溶于100mL沸水中，90℃孵育30min，待冷卻后過濾得樣品溶液，采用高效液相方法對樣品溶液進行檢測，使用Supelco Discovery RP

酰胺C16色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）進行梯度洗脫：流動相A：雙蒸水∶磷酸（99.95∶0.05；V/V）；流動相B：乙腈。梯度洗脫法進行洗脫如下：0～1min，2%B；2～60min，從2%B至50%B；柱溫：35℃；流速0.8mL/min；在210nm處進行檢測。根據相對保留時間和未知峰的紫外吸收為標準進行茶多酚成分的識別。

1.2.2模型制備小鼠HUA模型制備按照參考文獻［8］方法。稱取適量PO溶于生理鹽水中，充分混勻后給予250mg/kg劑量灌胃，連續7d。正常組給予灌胃等量生理鹽水。

1.2.3實驗分組與給藥60只昆明小鼠適應性喂養1周后隨機分成6組，每組10只，具體如下：正常組（灌胃生理鹽水）；模型組（灌胃PO造模1h后灌胃生理鹽水）；陽性組［8］灌胃PO造模1h后灌胃5mg/kg別嘌醇）；GTP低劑量組（灌胃PO造模1h后灌胃150mg/kg GTP）；GTP中劑量組（灌胃PO造模1h后灌胃300mg/kg GTP）；GTP高劑量組（灌胃PO造模1h后灌胃600mg/kg GTP）。所有實驗動物均在（23±2）℃下飼養，每天12h日光燈照射（7am～7pm），自由進食和飲水。以上各組連續灌胃7d。第7d給予藥物灌胃1h后，處死小鼠。

1.2.4取材分析乙醚麻醉小鼠后心臟取血，于4℃下靜置過夜，3000r/min離心10min，取血清保存于-70℃待用。小鼠肝臟，于冰上按1∶9的重量加入生理鹽水充分研磨，4℃下12000r/min離心15min，取上清液保存于-70℃下待用。用前4℃解凍，按照相關試劑盒說明書檢測出血清尿酸含量和血清、肝臟單位蛋白質條件下的XOD活性［9］。

2　結果與分析

2.1茶多酚高效液相檢測

通過對GTP進行高效液相檢測得出茶多酚的圖譜及茶多酚中不同組分的含量，分別見圖1及表1。

圖1　茶多酚高效液相檢測圖譜Fig.1　The chromatogram of GTP using a HPLC system

2.2GTP對血清尿酸含量的影響

由圖2可知，給予小鼠灌胃PO后，發現模型組小鼠血清尿酸含量與正常組相比顯著增高68%（p＜0.01）。給予陽性藥別嘌醇后，小鼠血清尿酸含量與模型組相比顯著減少45%（p＜0.01），這些變化程度與Chen［8］的研究中的結果相近。同樣，給予GTP灌胃300、600mg/kg劑量后，血清尿酸含量與模型組相比分別顯著減少22%和29%（p＜0.01）。但是在給予150mg/kg劑量灌胃時，血清尿酸含量與模型組沒有顯著性差異，但是具有降低的趨勢。

表1　茶多酚成分含量Table 1　Components content of GTP

圖2　GTP對HUA小鼠血清尿酸含量的影響Fig.2　Effect of GTP on serum uric acid content in HUA mice

2.3GTP對血清中XOD活性的影響

由圖3可知，給予小鼠灌胃PO后，模型組小鼠血清中XOD的活性與正常組相比顯著增高41%（p＜0.01）。給予別嘌醇后，小鼠血清中XOD活性與模型組相比顯著降低32%（p＜0.01），減少程度與之前Yan［9］的研究結果相近。給予GTP灌胃300、600mg/kg劑量后，小鼠血清中XOD活性與模型組相比分別顯著降低14%和21%（p＜0.05和p＜0.01）。在給予150mg/kg劑量灌胃時，血清中XOD活性與模型組沒有顯著性差異，但是具有降低的趨勢。

2.4GTP對肝臟中XOD活性的影響

由圖4可知，給予PO造模后，模型組小鼠肝臟中XOD活性與正常組相比顯著增高32%（p＜0.01）。給予陽性藥物別嘌醇后，小鼠肝臟中XOD活性與模型組相比顯著降低46%（p＜0.01）。給予GTP灌胃300、600mg/kg劑量后，小鼠肝臟中XOD活性與模型組相比分別顯著降低16%和21%（p＜0.05和p＜0.01）。在給予150mg/kg劑量灌胃時，肝臟中XOD活性與模型組沒有顯著性差異，但是具有降低的趨勢。

圖3　GTP對HUA小鼠血清中XOD活性的影響Fig.3　Effect of GTP on serum XOD activity in HUA mice

圖4　GTP對HUA小鼠肝臟中XOD活性的影響Fig.4　Effect of GTP on the liver XOD activity in HUA mice

3　討論

高尿酸血癥的定義為血清中尿酸含量男性≥7mg/dL，女性≥6mg/dL［10］。且體內約占含量的80%尿酸來源于內源性產生，包括體內氨基酸、核酸的代謝［11］。其中，嘌呤代謝過程中相關酶活性的增強是尿酸生成過多的主要原因，例如XOD能夠催化黃嘌呤代謝為次黃嘌呤并進一步生成尿酸，XOD活性的增加是導致尿酸生成的主要因素。在嚙齒類動物體內，嘌呤代謝生成的尿酸能夠通過尿激酶（uricase）的催化生成尿囊素（allantoin），以便于排出體外，但是該酶基因在人類及靈長類動物進化過程中丟失［12］。在本實驗中，采用氧嗪酸鉀抑制尿激酶的活性，來達到與人類相似的高尿酸血癥模型。在實驗結果中，模型組血清尿酸含量較正常組相比顯著升高（p＜0.01），在給予當前高尿酸血癥治療藥物別嘌醇后，陽性組與模型組相比尿酸含量顯著減少（p＜0.01）。說明使用該模型代表人類高尿酸血癥來進行研究是合理的。

茶在我國飲用歷史悠久已被視作世界三大飲料之一［13］，在其走向全球化的同時，各國研究人員也在對其生物活性功能不斷進行研究開發。包括抗氧化及清除體內自由基［14］、抑菌［15］、抗病毒［16］、改善心血管類疾?。?7］、抗癌抗腫瘤［18］等活性，但是茶多酚對于高尿酸血癥的影響及相關機制尚待明確。在本實驗中，發現茶多酚在300、600mg/kg劑量時，能夠明顯減少小鼠血清中的尿酸含量（p＜0.01）。且在相關研究中已經證實茶多酚對小鼠LD50為（2496±326）mg/kg［19］。在本實驗中采用的劑量明顯低于該劑量，說明茶多酚在其安全劑量下對于高尿酸血癥小鼠具有明顯改善作用。

XOD廣泛存在于各種動物及人體內，從其在器官上的分布來看，主要分布于肝臟及小腸中［20］。但是高尿酸血癥患者體內由于肝臟代謝活動增強，導致肝細胞細胞膜的通透性增加，使得血清中XOD的含量與體內XOD的含量呈現一定的數量關系［20］。但是由于細胞膜的選擇性通過，使得部分物質對于血清及肝臟中XOD的影響不盡相同［21］，因此將肝臟及血清中的XOD的活性作為檢測指標來體現小鼠體內XOD的活性。在本實驗中，模型組的血清及肝臟中XOD的活性較正常組相比具有顯著性增加（p＜0.01）。在給予灌胃300、600mg/kg劑量茶多酚時，血清及肝臟中的XOD的活性均具有顯著性降低（p＜0.05或p＜0.01）。在GTP灌胃150mg/kg劑量組中，其XOD活性與模型組相比沒有顯著性降低，但是具有降低的趨勢，可能與其給予的劑量還不足于明顯影響肝臟中XOD的表達，且隨劑量的增加，其抑制效果越明顯。說明茶多酚具有降低小鼠血清及肝臟中XOD活性的作用，且具有劑量依賴性。

在實驗中發現，給予茶多酚600mg/kg劑量，其抑制體內XOD活性及降低血清尿酸含量的的作用較模型組相比均具有較大的作用（p＜0.01）。由于別嘌醇在其口服劑量范圍內具有顯著的毒副反應，從而限制了其在臨床的的應用［22］，因此接下來的工作是通過研究給予別嘌醇治療的同時如何應用茶多酚作為補充藥物，以便于在保證效果的同時降低別嘌醇在臨床上的劑量，來降低其毒副作用。

4　結論

本研究證實，GTP能減少高尿酸血癥模型小鼠血清尿酸水平，其作用機制與抑制小鼠肝臟及血清中XOD活性密切相關。雖然其效果不及臨床用藥——別嘌醇明顯，但是通過本研究，為將GTP開發為新的降尿酸藥物或輔助藥物提供了實驗依據。

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Study on effect and mechanism of tea polyphenols on serum uric acid in hyperuricemic mice

TAN Ming-liang1，2，CHEN Gang1，2，3，*
（1.Chongqing Key Laboratory of Nature Medicine Research，Chongqing Technology and Business University，Chongqing 400067，China. 2.Chongqing Key Laboratory of Catalysis and Functional Organic Molecules，Chongqing Technology and Business University，Chongqing 400067，China. 3.School of Environmental and Biological Engineering，Chongqing Technology and Business University，Chongqing 400067，China）

To explore the effect of tea polyphenols on hyperuricemia（HUA）in mice and its potential mechanism，HUA was induced by intragastric administration of potassium oxonate in mice.HUA mice were treated with 150，300 and 600mg/kg tea polyphenols for 7 days.Uric acid level in serum was tested by phosphotungstic acid assay.Xanthine oxidase activity in serum and liver was determined by chemical colorimetric assay. Results showed that after treatment with 300 and 600mg/kg tea polyphenols，serum level of uric acid markedly reduced by approximate 22%and 29%（both p＜0.01）compared with that of model group.Meanwhile，xanthine oxidase activity in serum markedly decreased by approximate 14%（p＜0.05）and 21%（p＜0.01），as well as the liver xanthine oxidase activity markedly decreased 16%（p＜0.05）and 21%（p＜0.01）.In conclusion，tea polyphenols might reduce the level of uric acid in hyperuricemic mice，and the hypouricemic effect of tea polyphenols might be closely associated with the inhibition of xanthine oxidase activity.

tea polyphenols；hyperuricemia；xanthine oxidase；uric acid

TS201.4

A

1002-0306（2015）12-0349-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.066

2014－09－27

譚明亮（1990-）男，碩士研究生，研究方向：生物質資源化利用。

陳剛（1974-）男，博士，副研究員，研究方向：天然產物抗炎免疫調節作用與機制研究。

重慶工商大學科學研究項目（1352010）。