葡萄籽提取物對健康人體尿液的代謝組學研究

向　　歡，高　耀，彭國茳，吳麗君，田俊生，*

（1.山西大學體育學院，山西太原030006；2.山西大學中醫藥現代研究中心，山西太原030006）

葡萄籽提取物對健康人體尿液的代謝組學研究

向歡1，高耀2，彭國茳2，吳麗君1，田俊生2，*

（1.山西大學體育學院，山西太原030006；2.山西大學中醫藥現代研究中心，山西太原030006）

目的：采用1H-NMR代謝組學技術研究口服葡萄籽提取物后人體尿液中內源性代謝產物的變化規律。方法：選擇16名健康男生隨機平均分成兩組，即試食組（A）和對照組（B）。試食組每人每天口服葡萄籽提取物軟膠囊2粒，連續14d，對照組連續服用安慰劑14d。分別收集試食組及對照組服藥前（0d）和服藥后（14d）的晨尿，運用1H-NMR代謝組學技術分析尿液中內源性代謝產物的變化及其規律。結果：與對照組相比，服藥14d后，試食組人體尿液中乳酸水平下降，肌酐水平上升，且具有顯著性差異（p＜0.05，0.01）；結論：葡萄籽提取物（GSE）對人體尿液中內源性代謝產物的調節作用顯著，涉及能量代謝和氨基酸代謝通路，對能量代謝的調節尤為顯著，是一種很好的運動營養補充劑。1H-NMR代謝組學技術在運動科學研究中的應用前景廣闊。

代謝組學，葡萄籽提取物，尿液，核磁共振，代謝產物

葡萄籽提取物（Grape Seed Extract，GSE）中的主要活性成分為原花青素，是一類具有較高生物活性的黃酮類物質［1］，分子中含有多個酚羥基，可以有效清除有害的氧自由基，是一種高效抗氧化劑，對自由基引起的過氧化損傷具有保護作用［2-3］，而導致骨骼肌損傷和疲勞的重要原因之一就是運動引起骨骼肌自由基和其他形式的活性氧增加［4］，因此，葡萄籽原花青素不僅是一種很好的運動營養補充劑，具有抗疲勞、提高運動能力的作用，而且，可以抑制紅細胞膜和低密度脂蛋白過氧化，促進內皮細胞松弛因子的形成，防止血小板凝聚［5-8］。

代謝組學（Metabonomics）是研究機體代謝產物譜變化的一種系統生物學方法，可通過揭示新陳代謝動態進程中代謝產物的變化規律，全面理解機體內物質的代謝途徑［9-10］。它以高通量、大規模實驗方法和計算機統計分析為特征，具有“系統性”、“整體性”和“動態性”的特點［11-12］。1H-NMR、LC-MS、GCMS是代謝組學研究中常用的分析方法［13］，尤以1HNMR技術最為常用［14］。代謝組學分析的數據采集會得到多元性、復雜性的數據，需要借助專門的數據分析軟件進行分析，模式識別分析如主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）以及正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）是代謝組學數據處理過程中應用最多的方法［11］。近年來，代謝組學在運動科學研究領域的應用逐年增加，代謝組學通過分析運動導致內源性物質的變化，進一步發現新的代謝通路，為運動人體科學的發展提供一個新的思路［15-16］。本文采用1H-NMR方法結合多元統計分析人體尿液中代謝產物的變化及其規律，旨在為探討葡萄籽原花青素干預對人體代謝產物的影響機制的研究提供科學依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

千林葡萄籽提取物軟膠囊（0.4g×90粒，每100mg含原花青素21.5mg）（20120810）廣東保瑞藥業有限公司。

Bruker 600 MHz Avance III NMR譜儀德國布魯克公司；Centrifuge TDL-5型離心機上海安亭科學儀器廠；D2O美國默克試劑公司；其他試劑均為分析純。

1.2實驗對象

實驗對象為山西大學體育學院體育教育專業大二的健康男生，共16名，隨機分為試食組（A）和對照組（B），每組8人，平均年齡（19.54±0.84）歲，身高（178.29±4.35）cm，體重（69.14±6.19）kg。所有受試者均簽署知情同意書并經過病史詢問，排除循環、呼吸系統重大疾病史及近期內上呼吸道感染史，且近期都沒有服用維生素E、維生素C等自由基清除劑以及其他中藥補劑。并且實驗期間，所有受試者避免海鮮、辛辣食物，飲食清淡，禁止飲酒、吸煙以減少食物對代謝造成的波動，避免劇烈的運動。

1.3實驗方案及尿液樣本收集

實驗前（0d）清晨8∶00～9∶00空腹留取全部受試者尿液約10mL于EP管中。實驗開始后，試食組每人每天口服葡萄籽提取物軟膠囊2粒，連續14d，溫水送服；對照組則口服外觀相似的安慰劑（淀粉膠囊），連續14d。第15d清晨8∶00～9∶00再次空腹留取尿液約10mL。全部尿液樣本在3000r/min離心10min，上清液于-80℃冰箱保存，待測。

1.41H-NMR代謝組學分析

1.4.1尿液樣本預處理取解凍后的尿液樣本500μL，置于1.5mL Eppendorf管中，加入200μL D2O配制的磷酸緩沖液（0.2mol/L Na2HPO4/0.2mol/L NaH2PO4， 81∶19，v/v，pH=7.40），并加入適量0.15%TSP（3-三甲基硅基氘代丙酸鈉）作為化學位移零點的定標。4℃下13000r/min離心15min，取上清液600μL置于5mm的核磁管中待測。

1.4.21H-NMR測定條件采用NOESY脈沖序列進行樣本測定，參數設置為譜寬為8kHz，混合時間為0.15s，弛豫延遲為320ms，采樣點數64k，累加次數64。在弛豫延遲期間采用預飽和方式抑制水峰，譜儀偏置設置在水峰位置，自由感應衰減信號經過傅里葉變換轉換為1H-NMR圖譜。

1.4.31H-NMR譜圖處理采用MestReNova（Mestrelab Research，Santiago de Company，Spain）核磁圖譜處理軟件對所有1H-NMR圖譜進行相位、基線調整，并以TSP峰參考調零進行化學位移的校正。參考文獻［17-18］并結合Chenomx NMR Suite數據庫（加拿大Chenomx Inc.公司）軟件對譜圖峰進行歸屬。以δ 0.02為單位進行分段積分，同時排除包含水峰和尿素峰的部分（δ 4.6～6.4），即得到與化學位移值段相對應的積分值。采用歸一化法，將數據歸一化處理，使數據集中在0～1范圍內，所得數據輸出并轉換為Excel文件保存，用于多元統計分析。

1.4.4多元統計學分析應用SIMCA-P 13.0（Umetric，Sweden）將積分數據中心化和規格化后，應用偏最小二乘判別分析（PLS-DA）對數據進行分析。使用SPSS 17.0（Chicago，IL，USA）軟件，采用獨立樣本t檢驗，對具有差異的代謝產物進行統計分析，數據以±s表示。

2　結果與分析

2.11H-NMR圖譜的指認與分析

依據每個代謝物的化學位移，裂峰情況及耦合常數，并結合Chenomx NMR Suite軟件對1H-NMR譜圖進行指認分析。從圖譜中指認出24個代謝物，如圖1所示，主要包括氨基酸、有機酸等，化學位移指認結果見表1。

圖1　人體尿液樣本1H-NMR譜圖Fig.1　1H-NMR spectra from urine samples

2.2試食組不同時間點尿液1H-NMR譜圖的PLSDA分析

試食組不同時間點尿液PLS-DA分析結果如圖2所示。由圖2可知，試食組2個不同時間點的尿液樣本沿t［1］軸分開，表明口服葡萄籽提取物（GSE）后，人體尿液樣本中的內源性代謝產物發生了變化。

表1　人體尿液樣本中1H-NMR圖譜中主要代謝產物峰歸屬Table 1　Peak attribution of main metabolites in1H-NMR spectra for urine sample

圖2　試食組不同時間點尿液1H-NMR譜PLS-DA散點圖Fig.2　PLS-DA scores plot in1H-NMR spectra for urine samples from GSE-treated group at different periods

2.3服藥后試食組和對照組尿液1H-NMR譜圖PLS-DA分析

服藥后試食組和對照組尿液1H-NMR譜圖PLSDA分析結果如圖3所示。由圖3可以看出，試食組第（14d）與對照組（0d）、試食組（0d）以及對照組（14d）分開，說明試食組（14d）尿液中代謝產物變化較為顯著，即口服葡萄籽提取物（GSE）對尿液代謝產物影響較大；而對照組（14d）、對照組（0d）和試食組（0d）分開趨勢不明顯，表明實驗14d后，對照組尿液樣本內源性代謝產物變化不顯著，即安慰劑對體內代謝產物影響較小。

圖3　服藥后試食組和對照組尿液1H-NMR譜圖PLS-DA分析Fig.3　PLS-DA scores plot in1H-NMR spectra for urine samples of GSE-treated group and placebo-treated group

為了進一步探討口服GSE后尿液中內源性代謝產物的變化及其規律，采用多元統計分析對試食組（14d）和對照組（14d）的尿液1H-NMR譜圖進行單獨分析，結果如圖4所示。其中圖4（a）為PLS-DA分析散點圖，由圖可知，試食組與對照組沿t［1］軸分開，表明兩組尿液中的代謝產物水平存在差異。圖4（b）是PLS-DA分析模型驗證圖，模型驗證通過R2和Q2評價模型的擬合情況和預測能力，R2和Q2介于0和1之間，越接近1表示模型越有效［19-20］。圖4（b）中R2（0.575）和Q2（0.831）的回歸線與左邊縱軸相交，且左邊的R2和Q2實驗值低于右邊的原始值，可見上述方法模型是可靠有效的。為找出變化顯著的代謝產物，得到試食組和對照組PLS-DA分析載荷圖，如圖4（c）所示。依據圖中離原點遠的點VIP值較大，變量VIP值越大，對分組的貢獻就越大的原則，得到7個VIP值＞1的代謝產物（乳酸、檸檬酸、肌酐、肌酸、牛磺酸、甘氨酸、苯乙尿酸）。用SPSS軟件對這些代謝產物的相對峰面積進行獨立樣本t檢驗，結果如圖4（d）所示，由圖可知，口服GSE 14d后，與對照組相比，乳酸和肌酐兩個代謝產物的水平變化具有顯著性差異（p＜0.05）。

圖4　服藥后試食組和對照組尿液1H-NMR譜圖PLS-DA分析Fig.4　1H-NMR spectra for urine samples of GSE-treated group and placebo-treated group

3　討論

自由基是機體正常代謝的產物，是生命活動中必不可少的能量載體。正常情況下，生物機體內自由基維持在一種平衡狀態，但在出現運動疲勞、疾病等狀況時，機體內自由基的產生與清除則會失去平衡。研究表明原花青素能夠有效清除機體內過多的自由基［21-22］，但運用1H-NMR代謝組學技術從機體整體角度探討原花青素對尿液代謝產物的影響及其機制研究的文獻報道較少。

本文采用1H-NMR代謝組學技術對服用原花青素引起的體內代謝物的變化規律進行動態觀察，探討原花青素對人體內源性代謝物的影響機制。由1HNMR圖譜及模式識別分析發現，與對照組相比，試食組中乳酸和肌酐水平顯著改變。

乳酸是機體無氧代謝的產物，即機體供能過程中，糖在無氧或氧氣不足情況下酵解的最終產物，在供能體系中占有重要地位。在正常的新陳代謝中，機體中基本處于酸堿平衡狀態，乳酸雖然會不斷被產生，但其濃度不會明顯升高。當機體劇烈運動時，機體內供能加快，糖酵解供能比例增加。同時，乳酸產生速度加快，無法被及時運走而在機體內堆積，濃度增加，造成機體內pH降低，導致機體運動能力下降，產生疲勞［23］。在本實驗中，與對照組相比，試食組尿液中乳酸水平明顯下降，可能是葡萄籽提取物（GSE）提高了機體的有氧代謝所致。

肌酐是骨骼肌中肌酸與磷酸肌酸通過自發和不可逆的脫水縮合而形成的。一般情況下，機體內肌酐含量基本穩定，每日排出量變化很小，飲水量、飲食以及利尿劑等對肌酐的排出率沒有太大的影響，被用于尿液中毒物含量檢測的校正。實驗中經常用肌酐量來表示被測物濃度水平與接觸濃度有較好的相關性。而肌酸是由甘氨酸、甲硫氨酸以及精氨酸等3種必須氨基酸組成，前體為磷酸肌酸，是制造人體細胞能量——三磷酸腺甘（ATP）最重要的化學物質之一。機體中大約95%的肌酸儲存在骨骼肌中，骨骼肌中的肌酸與高能磷酸鍵結合以磷酸肌酸的形式貯存自由能，以供應機體做功所需能量。正常情況下，機體內肌酸庫穩定，當機體劇烈運動時，機體所需能量增加，骨骼肌中肌酸與磷酸肌酸作用加快，轉化為肌酐隨尿液排除體外［24-25］。本實驗研究結果顯示，試食組（14d）尿液中肌酐水平顯著升高，說明口服葡萄籽提取物（GSE）后，機體供能加快，運動能力增強。

本實驗運用1H-NMR代謝組學技術對口服葡萄籽提取物（GSE）后人體尿液中內源性代謝產物的變化及其規律進行探討，結果表明葡萄籽提取物（GSE）對人體尿液內源性代謝物的調節作用明顯，關于葡萄籽提取物的機理有待進一步深入研究。

4　結論

初步證實了葡萄籽提取物（GSE）對人體尿液中內源性代謝產物的調節作用顯著，對機體代謝產物的調節涉及能量代謝和氨基酸代謝等代謝通路，對能量代謝的調節作用尤為顯著，具有提高運動能力、抗疲勞的功效，是一種較好的營養補充劑，可以作為運動損傷及康復保健的理想選擇。本研究為葡萄籽提取物的功效及作用機制研究提供實驗依據。

［1］孫欣，王璐，趙辰硯.葡萄籽提取物對男女皮劃艇運動員的抗氧化能力與運動能力差異的研究［J］.浙江體育科學，2013，35（5）：107-110.

［2］Bagchi D，Garg A，Krohn R L，et al.Oxygen free radical scavenging abilities of vitamins C and E，and a grape seed proanthocyanidin extract in vitro［J］.Research Communications in Molecular Pathology and Pharmacology，1997，95（2）：179-189.

［3］Bagchi D，Garg A，Krohn R L，et al.Protective effects of grape seed proanthocyanidins and selected antioxidants against TPA-induced hepatic and brain lipid peroxidation and DNA fragmentation，and peritoneal macrophage activation in mice［J］. General Pharmacology：The Vascular System，1998，30（5）：771-776.

［4］胡紅梅，許豪文.運動性內源自由基對大鼠心肌線粒體功能的影響［J］.中國運動醫學雜志，1998，17（1）：23-26.

［5］Ricardo J M，Rigau J，Cheynier V，et al.Procyanidin dimers and trimers from grape seeds［J］.Phytochemistry，1991，30（4）：1259-1264.

［6］Kolodzieja H.Procyanidins from medicinal birch：bonding patternsandsequenceofunitsintriflavanoidsofmixed stereochemistry［J］.Phytochemistry，1989，28（12）：3487-3492.

［7］Saito M，Hosoyama H，Ariga T，et al.Antiulcer activity of grape seed extract and procyanidins［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1998，46（4）：1460-1464.

［8］江海洋，張華.葡萄籽原花青素的研究進展［J］.臨床誤診誤治，2012，25（11）：97-100.

［9］Nicholson J K，Lindon J C.System biology：metabonomics［J］. Nature，2008，455（7216）：1054-1056.

［10］Nicholon J K，Lindon J C，Holmes E.Metabonomics：understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data［J］.Xenobiotica，1999，29（11）：1181-1189.

［11］朱超，胡坪，梁瓊麟，等.代謝組學技術的整合運用及其在中藥現代化中的應用展望［J］.中國學術期刊文摘，2008，14（21）：9.

［12］Tian J S，Shi B Y，Xiang H，et al.1H-NMR-Based metabonomic studies on the Anti-depressant effect of genipin in the chronic unpredictable mild stress rat model［J］.PLoS One，2013，8（9）：e75721.

［13］Dunn W B，Bailey N J C，Johnson H E.Measuring the metabolome：current analytical technologies［J］.Analyst，2005，130（5）：606-625.

［14］Li L，Sun B，Zhang Q，et al.Metabonomic study on the toxicity of Hei-Shun-Pian，the processed lateral root of Aconitum carmichaelii Debx.（Ranunculaceae）［J］.Journal of Ethnopharmacology，2008，116（3）：561-568.

［15］黃彩華，歸予恒，林東海.代謝組學：運動人體科學研究的新工具［J］.體育科學，2011，31（9）：77-84.

［16］李江華，劉承宜，徐曉陽，等.2006年多哈亞運會短距離游泳男運動員代謝組學研究［J］.體育科學，2008，28（2）：42-46.

［17］Huang C，Lei H，Zhao X，et al.Metabolic influence of acute cyadox exposure on kunming mice［J］.Journal of Proteome Research，2012，12（1）：537-545.

［18］Ghosh S，Sengupta A，Sharma S，et al.Metabolic fingerprints of serum，brain，and liver are distinct for mice with cerebral and noncerebral malaria：a1H NMR spectroscopy-based metabonomic study［J］.Journal of Proteome Research，2012，11（10）：4992-5004.

［19］Yang S O，Shin Y S，Hyun S H，et al.NMR-based metabolic profilinganddifferentiationofginsengrootsaccordingto cultivation ages［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2012，58（25）：19-26.

［20］何盼，李震宇，范圣此，等.基于代謝組學技術和ITS2序列的恒山黃芪與川黃芪差異性研究［J］.藥學學報，2013，48（10）：1595-1601.

［21］Yoshida T，Shiny S，Hyun S H，et al.Studies on inhibition mechanism of autoxidation by tannins and flavonoids V Radicalscavenging effects of tannins and related polyphenols on 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical［J］.Chemical&Pharmaceutical Bulletin，1989，37（7）：1919-1921.

［22］Shimada K，Fujikawa K，Yahara K，et al.Antioxidative properties of xanthan on the autoxidation of soybean oil in cyclodextrinemulsion［J］.JournalofAgriculturalandFood Chemistry，1992，40（6）：945-948.

［23］馮煒權.運動訓練生物化學［M］.北京：北京體育大學出版社，1998：40-72.

［24］Murray R K.Harper’s biochemistry［M］.北京：科學出版社，2000.

［25］王自勉.肌酐測試在體育中應用的理論研究［J］.體育科研，1990，1（1）：41-43.

Effect of grape seed extract on endogenous metabolites in human urine

XIANG Huan1，GAO Yao2，PENG Guo-jiang2，WU Li-jun1，TIAN Jun-sheng2，*
（1.School of Physical Education，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

Objective：To investigate the changes of endogenous metabolites in Human urine after administration of grape seed extract（GSE）via NMR-based metabolomics.Methods：Sixteen healthy male students were randomly and averagely divided into two groups（A and B）.The volunteers in the group（A）were administrated 2 GSE capsules per day for 14 days，while those in the group（B）were given the Placebo capsules only.Urine samples were collected at 0th and after administration of grape seed extract（14th）individually.The urine samples were analyzed with technique of1H-NMR and pattern recognition.Results：Compared with the Placebo-treated group，the levels of lactate decreased and the levels creatinine increased significantly in the GSE-treated group（p＜0.05，0.01）.The level of lactate，creatin，taurine in GSE-treated group were lower than the placebo-treated group with significant difference（p＜0.05）.Conclusion：As one of good nutrition supplements for sports，administration of GSE heavily regulated the endogenous metabolites，which involved with the energy metabolism and amino acid metabolism.The application of1H-NMR metabolomics technology in sports science will be in spread in the future.

metabolomics；grape seed extract（GSE）；urine；1H-NMR；metabolites

TS201.1

A

1002-0306（2015）12-0344-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.065

2014－11－18

向歡（1984-），女，碩士研究生，助教，研究方向：運動保健與中醫藥康復。

田俊生（1980-），男，博士，副教授，研究方向：中藥藥理與新藥研發。

國家自然科學基金項目（81102833）。