羊棲菜硫酸多糖的超聲輔助提取工藝優化及抗氧化活性研究

董　樂，董笑瀛，王　芳，*，戴聰杰，林志杰，陳洪彬，劉燦陽

（1.泉州師范學院化學與生命科學學院，近海資源生物技術福建省高校重點實驗室，福建泉州362000；2.吉林大學臨床醫學院，吉林長春130000）

羊棲菜硫酸多糖的超聲輔助提取工藝優化及抗氧化活性研究

董樂1，董笑瀛2，王芳1，*，戴聰杰1，林志杰1，陳洪彬1，劉燦陽1

（1.泉州師范學院化學與生命科學學院，近海資源生物技術福建省高校重點實驗室，福建泉州362000；2.吉林大學臨床醫學院，吉林長春130000）

為開發利用羊棲菜資源，對羊棲菜多糖（Sargassum fusiforme polysaccharides，SFPS）的提取工藝及其抗氧化活性進行了研究。在單因素實驗基礎上，通過二次回歸正交旋轉組合設計對超聲波輔助提取SFPS粗品的工藝條件進行優化，得到最佳工藝參數為：超聲時間13min、提取溫度87℃和液料比46∶1mL·g-1，此時SFPS粗品提取率為8.23%± 0.01%。粗品中SFPS含量為31.20%±0.74%，硫酸根含量為10.93%±0.24%；SFPS的硫酸基含量41.88%±2.24%，SFPS為硫酸多糖。在一定范圍內，SFPS粗品的抗氧化能力與多糖質量濃度呈線性正相關，對·OH、DPPH·、ABTS+·和O2-·的半數清除濃度（IC50）值分別為0.7068、0.4814、0.2527、1.2350mg·mL-1。

羊棲菜硫酸多糖，二次回歸正交旋轉組合設計，抗氧化活性

羊棲菜〔Sargassum fusiforme（Hary）Setch.〕屬馬尾藻科（Sargassaceae）、羊棲菜屬（H izikia）［1］，在我國廣泛分布于浙江、遼寧、山東、福建等省的沿海，其中以浙江溫州地區尤為豐富［2］。羊棲菜營養豐富，尤其含有豐富的多糖［3］。各種動物實驗和臨床實驗表明，羊棲菜多糖（Sargassum fusiforme polysaccharides，SFPS）具有免疫調節活性［4］、抗突變［5］、抗腫瘤［6］、抗凝血［7］、抗病毒［8］、降血脂［9］、降血糖［10］等生理活性。目前提取多糖常見方法有熱水浸提、冷水浸提、酶法浸提、超聲波提取和微波提取法［11］。超聲波輔助提取通過其機械效應、空化效應及熱效應，使介質分子的運動頻率和速度增大，介質的穿透力增強，加速植物細胞壁的破裂，提高植物中活性成分的提取效率［12］。羊棲菜的藻體較硬，適合用機械的方法對其細胞壁進行破碎來提取多糖。張勝幫等［13］用超聲波輔助法，采用L16（45）正交試驗優化了提取SFPS的工藝條件。

二次回歸正交旋轉組合設計能以較少的實驗處理建立一個有效的多項式回歸方程，從而解決最優化問題，并尋找實驗指標與各因子間的定量規律。本實驗采用二次回歸正交旋轉組合設計對超聲波輔助提取SFPS粗品的工藝條件進行優化，建立回歸數學模型；并以對·OH、DPPH·、ABTS+·和O2-·的清除率為指標，評價SFPS粗品的抗氧化活性，為SFPS功能活性的深入研究及其多糖產品的開發提供理論依據和技術支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

羊棲菜購于浙江溫州洞頭縣匯源海生物開發有限公司，自然干燥，用清水淋洗瀝干水分后55℃烘干，粉碎后過80目篩密封備用；95%乙醇、無水乙醇、氯仿、正丁醇、木瓜蛋白酶、濃硫酸、苯酚、氯化鈣、標準糖（葡聚糖、葡萄糖、巖藻糖/半乳糖3∶1）、三氯乙酸、氯化鋇、明膠、鹽酸、氯化鈉、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、溴化鉀、過氧化氫國產分析純；DPPH、ABTS、透析袋（截留相對分子質量3500ku） 廈門泰京生物科技有限公司；水超純水。

W2-100S旋轉蒸發儀上海申生科技有限公司；HH-4恒溫水浴鍋常州國華電器有限公司；KQ-600超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；GZX-9240MBE數顯鼓風干燥箱上海博迅實業有限公司醫療設備廠；TU-1950雙光束紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；SHZ-III型循環水真空泵上海亞榮生化儀器廠；TDL-500B型低速大容量離心機上海安亭科學儀器廠；FA2104N型電子分析天平上海菁海儀器有限公司；ZNCL-B智能恒溫磁力攪拌器鞏義市予華儀器有限責任公司；FW100型高速萬能粉碎機天津市泰斯特儀器有限公司；PHSJ-4A實驗室pH計上海精密科學儀器有限公司；LGJ-10D冷凍干燥機北京四環科學儀器廠有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1羊棲菜干粉水分含量的測定根據GB 5009.3-2010《食品安全國家標準—食品中水分的測定》第一法［14］測定羊棲菜干粉中的水分含量。

1.2.2SFPS粗品的提取準確稱取一定重量粉末（WF）→加80%乙醇→80℃、2h脫色脫脂、烘干→稱重（WT）→計算產物的凈重率（WN）公式如下：

WT=WF×WN

準確稱取折算為WF=5.00g粉末的上述產物WT，按單因素實驗設計的液料比加水，并于常溫下經超聲波輔助提取后，按單因素實驗設計的條件繼續提取，離心后取上清液，沉淀按原液料比重新溶解，繼續提取2h，離心后取上清液。合并2次的上清液進行減壓濃縮后，用木瓜蛋白酶結合Sevag法［15］脫蛋白，重復2次，收集合并上清液，向其中加入乙醇和CaCl2，使其終濃度分別為20%和0.05mol·L-1，然后置于4℃過夜。室溫下，4000r·min-1，離心10min后，收集的上清液進行透析48h。于減壓濃縮的截留液中加入乙醇，使其終濃度為75%，靜置4h，無水乙醇洗滌1次后，置于55℃烘干，即獲得SFPS粗品（WS）。稱重后計算SFPS粗品提取率，并測定粗品中SFPS含量及硫酸根含量。

SFPS粗品提取率（%）=WS/［WF×（1－水分含量）］

1.2.3單因素實驗設計準確稱取羊棲菜粉末5.0000g分別按液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1mL·g-1，提取溫度50、60、70、80、90℃，超聲時間10、20、30、40、50min進行單因素實驗，其中固定液料比30∶1mL·g-1，溫度80℃，時間30min，實驗均重復3次。

1.2.4二次回歸正交旋轉組合實驗以液料比、提取溫度和超聲時間為實驗因素，以SFPS粗品提取率為響應值，進行3因素3水平的分析實驗，優化SFPS粗品提取工藝條件。實驗因素和水平見表1。

表1　二次回歸正交旋轉組合設計的因素水平編碼值表Table 1　Factors and levels of quadratic regression rotatable orthogonal design

1.2.5粗品中SFPS含量的測定采用苯酚－硫酸比色法［16］。

將SFPS粗品配制成200μg·mL-1溶液。取0.5mL定容液（用蒸餾水補足2mL），然后加入1.0mL 6%苯酚及5.0mL濃H2SO4，搖勻冷卻至室溫，放置20min后測溶液的吸光度（A）。每次測定取雙樣。以標準曲線計算SFPS含量。

SFPS含量（%）＝［C×V×D/WS］×100

式中，C—根據標準曲線計算出SFPS粗品的濃度（μg·mL-1）；V—SFPS粗品溶液定容的體積（mL）；D稀釋的倍數；WS—SFPS粗品的質量（g）。

1.2.6SFPS的硫酸根含量測定用氯化鋇－明膠比濁法［17］進行。

1.2.7SFPS粗品的抗氧化活性測定對·OH、DPPH·、ABTS+·和O2-·清除率的測定均按文獻進行［18-21］。

1.2.8半數清除（抑制）濃度（IC50）的計算以SFPS的濃度對自由基清除率作圖并進行線性擬合，并利用計算機插值法模擬計算IC50值。IC50值定義為清除率為50%時所需SFPS的濃度。

1.2.9統計學分析所有實驗至少重復3次。用Excel、SPSS 13.0軟件和Design-Expert 8.05軟件系統進行統計學處理，以p＜0.05判斷為有統計學意義。

2　結果與分析

2.1羊棲菜粉末的水分含量

羊棲菜干粉的含水量為6.54%±0.04%（n=3）。

2.2單因素實驗

2.2.1液料比對SFPS粗品提取率的影響結果如圖1所示，由于SFPS是水溶性多糖，隨液料比增大，SFPS粗品提取率增加。當液料比為30∶1mL·g-1時，SFPS粗品提取率達到最高，為4.21%，繼續提高液料比，SFPS粗品提取率反而下降。這可能是因為其它成分的溶解量隨液料比增加而增加，從而改變了提取液的性質，或者與SFPS發生了互作，造成SFPS粗品提取率降低。故選擇液料比為30∶1mL·g-1為宜。

圖1　液料比對SFPS粗品提取率的影響Fig.1　Effect of the ratio of liquid to solid on the yield of the crude SFPS

2.2.2提取溫度對SFPS粗品提取率的影響結果如圖2所示，SFPS粗品提取率隨著提取溫度升高而增加。由于溫度影響SFPS的活性，適宜的提取溫度一般小于100℃，因此本實驗選擇提取溫度為90℃。

圖2　提取溫度對SFPS粗品提取率的影響Fig.2　Effect of extraction temperature on the yield of the crude SFPS

2.2.3超聲時間對SFPS粗品提取率的影響粗品提粗品提結果如圖3所示。SFPS的提取過程與超聲處理時間密切相關。SFPS粗品提取率隨超聲時間延長而增加，當超聲時間達到30min時，SFPS粗品提取率達到最高6.01%。繼續增加超聲時間，SFPS粗品提取率反而下降。這可能是由于時間過長，大分子多糖在超聲波的強剪切作用下發生斷裂而損失，使提取率下降［17］。故超聲提取的時間選擇在30min為宜。

圖3　超聲時間對SFPS粗品提取率的影響Fig.3　Effect of ultrasonic-irradiation time on the yield of the crude SFPS

2.3SFPS粗品提取的工藝優化分析

2.3.1實驗設計與最佳工藝參數確定SFPS粗品提取的結果見表2。

表2　二次回歸正交旋轉組合實驗設計及結果Table 2　Quadratic regression rotatable orthogonal experiment design and the results of these experiments

利用Design-Expert 8.05軟件對實驗結果進行分析，得到以SFPS提取率為響應值的回歸方程：

由方差分析（見表3）可知，總的回歸關系極顯著，失擬項不顯著（p＞0.05），C.V.＝2.29%，精密度＝17.0231。R2Adj為0.9089，說明建立的模型能夠解釋90.89%響應值的變化，能很好地描述SFPS提取過程中提取率隨提取條件的變化規律。因此，該模型可用于預測SFPS提取過程中的提取率情況。

表3　二次回歸正交旋轉組合設計的方差分析Table 3　Analysis of variance（ANOVA）for the fitted quadratic polynomial model

由方差分析見表3。結果表明，提取溫度和超聲時間的交互作用顯著，但液料比與提取溫度及超聲時間之間的交互作用不顯著，超聲時間的一次項也不顯著，因此應當從回歸方程中剔除。

表4　二次回歸正交旋轉組合設計的二次方差分析Table 4　Quadratic analysis of variance（ANOVA）for the fitted quadratic polynomial model

將X1X2、X1X3和X3從回歸方程中剔除，且將其平方和和自由度并入實驗誤差，進行第二次方差分析，結果見表4。二次方差分析表明，除X1的二次項未達顯著外，其余各項均達顯著水平，但X12在0.10水平上顯著，所以應將其保留在回歸方程。失擬項不顯著（p＜0.05）。故回歸方程為：

在3個實驗因素的編碼范圍內，運用Excel規劃求解得到SFPS提取的最佳工藝參數為：液料比為45.8∶1 mL·g-1，提取溫度為87.4℃，超聲時間13min。考慮到實際操作的便利，確定優化提取工藝參數為：液料比為46∶1mL·g-1，提取溫度為87℃，超聲時間13min。在最佳工藝條件下SFPS粗品提取率預測值為8.54%。

2.3.2最佳工藝參數驗證性實驗在最佳工藝條件下SFPS粗品提取率的驗證值為8.23%±0.01%（n＝5），與理論預測值相比，相對誤差為3.6%（p＜0.05），證明了二次回歸正交旋轉組合設計優化SFPS的提取工藝參數的可行性。利用最優工藝提取的羊棲菜粗多糖命名為SFPS粗品。

2.4SFPS粗品的SFPS含量

SFPS粗品的SFPS含量測定標準曲線見圖4。葡萄糖標準品溶液在0～0.5360μg·mL-1濃度范圍內與吸光度線性關系良好，標準曲線回歸方程為y＝0.0134x－0.0089，r＝0.9983，n＝6。

圖4　葡萄糖標準曲線Fig.4　The standard curve of dextrose concentration

圖5　硫酸根標準曲線Fig.5　The standard curve of sulfate-radical concentration

SFPS粗品中SFPS含量為31.20%±0.74%（n＝3）。

2.5SFPS粗品的硫酸根含量

SFPS粗品的硫酸根含量測定標準曲線見圖5。硫酸根在0～67.6056μg·mL-1濃度范圍內與吸光度線性關系良好，標準曲線回歸方程為y＝0.0078x－0.0241，r＝0.9950，n＝6。

SFPS粗品的硫酸基含量為10.93%±0.24%（n＝3），SFPS的硫酸基含量41.88%±2.24%（n＝3），因此，SFPS為硫酸多糖。

2.6SFPS粗品的抗氧化活性

由圖6可見，SFPS粗品對·OH、DPPH·、ABTS+·和 O2-·均有一定的清除能力，對4種自由基的清除率均隨濃度增大而增強，且SFPS粗品的濃度與抑制自由基的能力均呈現出明顯的量效關系。在測定濃度范圍內，SFPS粗品對DPPH·的清除率達到一定程度趨于平衡。利用計算機插值法模擬結果表明，SFPS粗品對·OH、DPPH·、ABTS+·和O2-·的IC50分別為0.7068、0.4814、0.2527、1.2350mg·mL-1，分別低于維生素C對·OH、DPPH·、ABTS+·和O2-·的IC50，即分別低于0.5911、0.0814、0.0946、0.3912mg·mL-1。

圖6　SFPS粗品的抗氧化活性Fig.6　The antioxidative activity in vitro of the crude SFPS

3　結論

利用二次回歸正交旋轉組合優化超聲波輔助提取SFPS粗品的回歸數學模型為：＝3.36182＋0.04214X1＋0.11558X2－0.07004X3＋0.00093X2X3－0.00046X12－0.00073X22－0.00272X32。此模型在實驗范圍內能較準確預測SFPS粗品提取率。通過此數學模型，確定最優工藝參數：液料比46∶1mL·g-1、提取溫度87℃和超聲時間13min。在該工藝條件下SFPS粗品提取率預測值為8.54%，驗證值為8.23%±0.01%，說明二次回歸正交旋轉組合設計優化SFPS粗品的提取工藝參數是可行的。SFPS粗品中多糖含量為31.20%± 0.74%，硫酸根含量為10.93%±0.24%，SFPS的硫酸根含量為41.88%±2.24%，說明提取的SFPS為硫酸多糖。SFPS粗品對·OH、DPPH·、ABTS+·和O2-·的IC50分別為0.7068、0.4814、0.2527、1.2350mg·mL-1，抗氧化活性低于維生素C。

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Optimization of extraction and antioxidative activity in vitro of sulfated polysaccharides from Sargassum fusiforme（Hary）Setch.

DONG Le1，DONG Xiao-ying2，WANG Fang1，*，DAI Cong-jie1，LIN Zhi-jie1，CHEN Hong-bin1，LIU Can-yang1
（1.College of Chemistry and Life Science，Quanzhou Normal University，the Higher Educational Key Laboratory for Offshore Resources and Biotechnology of Fujian Province，Quanzhou Normal University，Quanzhou 362000，China；2.Clinical Medical College of Jilin University，Changchun 130000，China）

In order to exploit resources of Sargassum fusiforme（Hary）Setch.，the extraction and antioxidative activity of the polysaccharides from S.fusiforme（SFPS）was investigated respectively.Based on single experiments，with yield of crude SFPS as index，extraction temperature，ultrasonic-irradiation time and ratio of liquid to solid were selected as factors，the extraction technology of the crude SFPS was optimized by quadratic regression rotatable orthogonal combinition design method.The results showed that the optimal extraction conditions were 87℃，46∶1mL·g-1with 13min．The corresponding extraction yield of crude SFPS was 8.23%±0.01%.The sulfate-radical concentration of the crude SFPS was 10.93%±0.24%.The SFPS content of the crude SFPS was 31.20%±0.74%.The sulfate-radical concentration of the SFPS was 41.88%±2.24%.The SFPS were sulfated.There was a linear positive correlation between the antioxidant ability of SFPS and the concentration in certain extent.The half-scavenging concentration IC50values of the crude SFPS against·OH，DPPH·，ABTS+·and O2-·radicals were 0.7068，0.4814，0.2527，1.2350mg·mL-1respectively.

sulfated polysaccharides from Sargassum fusiforme（Hary）Setch.；quadratic regression rotatable orthogonal design；antioxidative activity

TS254

A

1002-0306（2015）12-0265-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.047

2014－9－25

董樂（1966－），男，碩士，副教授，研究方向：食品生物技術研究。

王芳（1969－），女，博士，教授，研究方向：生物技術研究。

福建省科技項目計劃海洋經濟發展專項重點項目（2015N0014）；福建省高校服務海西建設重點項目（A101）；福建省生物學省級重點學科建設項目（zdxk）；泉州市“海納百川”高端人才聚集計劃高端海洋人才引進資助項目；泉州市科技計劃重點項目（2011Z16，2013Z126）；國家級大學生創新創業計劃項目（201310399009，201410399029）。