用蒸餾水法保藏產葡萄糖氧化酶畢赤酵母的研究

楊　　晴，李丕武，2，*，王　　升

（1.齊魯工業大學生物工程學院，山東濟南250353；2.山東省微生物工程重點實驗室，山東濟南250353）

用蒸餾水法保藏產葡萄糖氧化酶畢赤酵母的研究

楊晴1，李丕武1，2，*，王升1

（1.齊魯工業大學生物工程學院，山東濟南250353；2.山東省微生物工程重點實驗室，山東濟南250353）

以斜面保藏法為對照，考察了蒸餾水保藏法對產葡萄糖氧化酶畢赤酵母基因工程菌產酶和菌體存活率的影響。采用蒸餾水法和斜面法保藏菌種Pichia pastoris P51 180d后：菌體存活率分別為90%和45%，蒸餾水法保藏效果遠高于斜面保藏法；搖瓶發酵實驗最終產酶活力分別是（22.5±0.5）U/mL和（23±0.4）U/mL，蒸餾水法對畢赤酵母基因工程菌產酶沒有影響。另外蒸餾水法保藏畢赤酵母可在室溫下進行、操作簡便，與斜面保藏法相比具有一定的優勢。

蒸餾水法，斜面保藏法，畢赤酵母

隨著畢赤酵母基因工程菌研究的不斷深入，利用基因工程的方法將黑曲霉中葡萄糖氧化酶［1］基因導入到畢赤酵母中表達葡萄糖氧化酶成為研究熱點［2］。然而對產葡萄糖氧化酶畢赤酵母的保藏方法的研究較少，大部分學者仍采用傳統的斜面法和甘油管法保藏。斜面法保藏過程中培養基易失水干縮導致菌種失活，至少三個月需要轉管一次，需投入較多的時間和精力，同時，傳代次數增加導致的菌種退化和目的基因丟失也是不可忽視的問題。蒸餾水法自1939年Castellani首次應用于病原真菌保藏后，國內外學者先后在病原微生物［3］、食用菌［4］和工業微生物菌種［5］的保藏上進行了研究，此法對于霉菌和酵母菌的保藏效果要好于對細菌和放線菌［5］；最高保藏年限可達20年［6］；長期保藏后電鏡觀察，細菌會出現質壁分離現象［7］須引起注意；在蒸餾水中添加無機鹽、液體石蠟對保藏效果沒有影響［5］；保藏種子可減少畢赤酵母基因工程菌和其他微生物交叉污染［3］。本文首次采用構建的產葡萄糖氧化酶畢赤酵母為出發菌株，同時以斜面法作為對照，比較了蒸餾水法和斜面法保藏產葡萄糖氧化酶畢赤酵母180d內的干重、存活率和產酶能力。為蒸餾水法應用于基因工程菌的保藏奠定了基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）SMD1168 p51菌株由齊魯工業大學微生物酶技術實驗室構建（葡萄糖氧化酶外源基因序列GenBank登錄號為C333175）；蒸餾水：娃哈哈純凈水杭州娃哈哈集團有限公司；種子和活化培養基（1L）葡萄糖10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，pH自然（固體培養基加2%瓊脂）；發酵培養基：BMMY培養基見參考文獻［8］；辣根過氧化物酶Sigma，C9322；4-氨基安替比林國藥集團化學試劑有限公司；苯酚天津大茂化學試劑廠；Triton-100生工生物（上海）有限公司。

WFG 7200型可見光分光光度計尤尼柯（上海）；HR數顯恒溫水浴鍋江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；Eppendorf 5084R冷凍離心機Eppendorf公司；分析天平梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1搖瓶發酵方法種子培養和搖瓶發酵按照Invitrogen公司《畢赤酵母表達手冊》進行操作：在液體種子培養基中培養供試菌種至對數期（OD600nm為6左右），將菌體離心后，轉入到BMMY培養基中，使用甲醇誘導，之后發酵培養基中每隔12h添加甲醇至10g/L。

1.2.2斜面保藏法為了與蒸餾水法相比較，斜面中加入菌種后，直接保存至4℃冰箱中。并且斜面與蒸餾水法試管中加入的菌體量相同。

1.2.3蒸餾水保藏法菌液的制備：按照1.2中的方法培養菌液，生物量（OD600nm）約等于6左右；菌液離心：取菌液10mL，4000r/min、4℃下離心10min，棄去上清液；洗滌菌體：加入10mL蒸餾水重懸菌體，洗去附著在菌體上的培養基后，4000r/min、離心10min，反復洗滌3次；保藏用蒸餾水制備：將蒸餾水加入到試樣中121℃，滅菌30min。降溫后盡量避免晃動試管，使試管內隔絕空氣；保藏：在無菌條件下，將菌體加入到含10mL蒸餾水的離心管中并用封口膜封口，室溫保藏。

1.3測定方法

1.3.1菌體濃度的檢測使用分光光度計，測定600nm波長下的OD表示細胞濃度。

1.3.2干重的測量在斜面上加入5mL蒸餾水，用玻璃棒輕輕的攪拌制成菌體懸濁液，將菌懸液倒入離心管中，再次向斜面上加入蒸餾水清洗剩余的菌體，最后將離心管定容至10mL。4000r/min離心10min，蒸餾水洗滌菌體后再次離心，棄去上清液置于80℃燥箱中烘干至恒重稱量并計算干重；蒸餾水法保藏的菌種直接離心，離心、洗滌、烘干和計算方法同斜面法干重的測定。

式中，m和m0分別是烘干后的總質量和離心管的質量，g；V是離心管中的體積，mL。

1.3.3菌種存活率的測定以平板稀釋法［9］測定保藏菌種的活菌濃度，計算菌種存活率，計算公式如下：

式中，S0和S分別是剛制備好菌種平板計數法測定的活菌數和保藏后取樣活菌數，取樣時間分別是0、30、60、90、120、150、180d。

1.3.4酶活檢測葡萄糖氧化酶酶活性的測定采用連續分光光度法［10］。將分光光度計波長調至500nm，吸取2.0mL苯酚緩沖液、0.5mL底物溶液、0.5mL過氧化物酶溶液和0.1mL 4-氨基安替比林溶液至比色杯中（光程1cm），置于（37±0.1）℃水浴保溫10min，放入分光光度計中，將分光光度計調零。吸取0.1mL酶液加入比色杯中并立即吹吸混合均勻，計時。加酶液同時記吸光值為零，以后每隔1min記錄吸光值，連續記錄5min。利用該方法測定時，酶活力單位定義為：在上述反應條件下，每分鐘氧化1μmol的β-D-葡萄糖需要的酶量為一個酶活單位。酶活力計算公式如下：

式中，ΔA500：一定時間內500nm處吸光值變化（吸光值需對時間呈線性變化）；Δt：吸光值變化對應的反應時間，min；12.88：生成顯色物醌亞胺的毫摩爾消光系數，mmol-1·cm-1；1/2：每摩爾H2O2生成醌亞胺的摩爾數；Dm：酶溶液的稀釋倍數；0.1：酶溶液的體積，mL；3.2：反應混合物的終體積，mL。

1.3.5統計分析數據采用Origin進行T檢驗，分析結果的顯著性差（p＜0.05），數值以均值±標準偏差表示。

2　結果與分析

2.1兩種保藏方法對菌體量的影響

分別用蒸餾水法和斜面法進行菌種的保藏，保藏時間180d，按1.3.2測定菌體量的變化。

圖1　蒸餾水保藏法和斜面保藏法菌體干重的比較Fig.1　Comparision of the dry cell weight by slant preservation and distilled water preservation

結果如圖1所示。至30d時，兩種方法保藏的菌體干重均有增長，斜面法菌體干重達到了（2.0±0.2）g/L，約是蒸餾水法菌體干重的一倍。斜面保藏法的營養成分豐富，雖然在低溫下，菌體仍出現了擴增。而蒸餾水中沒有營養成分提供給菌體利用，菌體維持在休眠狀態，并且菌體沒有發生自溶現象。而90d以后，斜面法保藏菌種的干重開始穩定，可能是斜面營養物質的消耗有害代謝物的產生使菌體量不再增長。

2.2兩種保藏方法對菌體存活率的影響

根據1.3.3中的方法，檢測保藏6個月內存活率的變化，結果見圖2。

圖2　蒸餾水保藏法和斜面保藏法存活率的比較Fig.2　Comparision of the survival rate by slant preservation and distilled water preservation

由圖2可知，用兩種方法保藏菌種30d之后，斜面保藏法的菌種存活率為160%，大于蒸餾水保藏法的98%。畢赤酵母在斜面上存活率大于100%的原因是畢赤酵母菌在營養成分豐富的斜面培養基上，雖然溫度較低，仍然出現了一定的增長，導致保藏后的存活的菌體大于剛保藏時的活菌體。而蒸餾水法保藏的結果小于100%，培養基中沒有任何營養成分，剛保藏至蒸餾水中時可能會會導致了菌體部分自溶或死亡。從30～180d的蒸餾水法保藏存活率穩中有降最終的存活率是90%，蒸餾水法中的蒸餾水不含營養成分，菌體這個階段已經進入到休眠狀態，存活率的緩慢下降可能是發生了部分的自溶現象。與張滄桑［11］采用蒸餾水長期保藏釀酒酵母菌種180d的存活率相差不大。而斜面保藏法的存活率下降至45%，這與斜面培養基營養物質的消耗、有害代謝產物的積累、pH降低以及傳代次數增多有關。

2.3兩種保藏方法對畢赤酵母外源基因表達的影響

保藏效果可以通過菌種保藏后發酵最終產酶來評價。按照1.2.1方法分別對蒸餾水法和斜面法保藏的菌種進行活化。將活化后的種子接入到搖瓶發酵培養基中，每種種子的發酵做三個重復。每天取樣一次，測定OD600nm和酶活。

由搖瓶發酵結果圖3中可知，甲醇誘導9d內兩種種子的酶活都隨菌體密度的增加而增加，呈明顯的正相關。蒸餾水法和斜面保藏法保藏后最終發酵液中的葡萄糖氧化酶活力幾乎相同，分別為（22.5±0.5）U/mL和（23±0.4）U/mL，經過T檢驗分析，p＞0.05表明兩種方法保藏的菌種發酵結果沒有顯著性差異。表明蒸餾水法保藏畢赤酵母基因工程菌后保持了外源基因遺傳學特性。

3　結論

與其他保藏方法相比，蒸餾水法利用蒸餾水作為主要原料，操作簡單、成本低，適用于大部分微生物實驗室。蒸餾水法利用液體作為載體，避免了孢子或菌體在空氣中的飄散，減少了不同菌種的交叉污染以及病原菌的擴散。研究結果表明，蒸餾水法可用于產葡萄糖氧化酶基因工程菌的保藏并且保藏180d后，菌體的存活率達到了90%大于斜面保藏法的45%，優于斜面保藏法。而且菌體在蒸餾水中傳代次數減少，保藏180d干重維持不變，而斜面法干重增加了一倍。蒸餾水法更有利于保持遺傳學特性。蒸餾水法和斜面法保藏的菌種搖瓶發酵產酶分別是（22.5±0.5）U/mL和（23±0.4）U/mL，表明菌種經蒸餾水保藏后，產酶能力沒有下降。本研究為蒸餾水法應用于基因工程菌的保藏奠定了基礎。

圖3　畢赤酵母發酵過程曲線Fig.3　The curve of enzyme production and OD

［1］劉超，袁建國，王元秀，等.葡萄糖氧化酶的研究進展［J］.食品與藥品，2010，12（7）：285-289.

［2］劉瑜，李丕武.黑曲霉葡萄糖氧化酶高產基因工程菌研究進展［J］.生物技術通報，2013，16（7）：12-19.

［3］Fernández Andreu，Carlos Manuel，Díaz Suárez，et al. Preservation of high risk fungal cultures of Histoplasma and Cryptococcus［J］.Revista Cubana de Medicina Tropical，2012，64（3）：49-54.

［4］Diogo，Hilda C，Sarpieri，et al.Preservation of fungi in water（Castellani）：20 years［M］.Anais Brasileiros de Dermatologia，2005，80（6）：70-75.

［5］黃彬漢.采用蒸餾水生理鹽水保藏工業微生物菌種的初步探討［J］.食品與發酵工業，1983（6）：14-20.

［6］Iacobellis N S，Devay J E.Long-term storage of plantpathogenic bacteria in sterile distilled water［J］.Applied and Environmental Microbiology，1986，52（2）：388-389.

［7］侯志江，李榮春，程遠輝，等.菌種保藏條件對尖頂羊肚菌（Morchella conica）菌絲生長的影響［J］.西南農業學報，2012，25（3）：1056-1060.

［8］Higgins D R，Cregg J M.Pichia protocols［M］.New Jersey：Springer，1998.［9］陳在佴，張漢珍，吳繼星.蘇云金桿菌菌種保藏［J］.中國生物防治，1999，15（1）：20-23.

［10］李丕武，劉瑜，李瑞瑞，等.兩種葡萄糖氧化酶活力測定方法的比較［J］.食品工業科技，2013，34（12）：71-75.

［11］張滄桑，張渝，金良媛.無菌蒸餾水長期保藏酵母菌種的研究［J］.啤酒科技，2004（8）：25-26.

Study on the preservation of the Pichia pastoris recombinan producing glucose oxidase with distilled water

YANG Qing1，LI Pi-wu1，2，*，WANG Sheng1
（1.School of Biotechnology，Qilu University of Technology，Ji’nan 250353，China；2．Shandong Provincial Key Laboratory of Microbial Engineering，Ji’nan 250353，China）

The effect of preservation in distilled water on production of glucose oxidase with recombinant Pichia pastoris was investigated in comparision with the method of slant preservation.When the strain Pichia pastoris P51 was preserved with methods of distilled water preservation and slant preservation for 180 days，strain survival rate reached 90%and 45%，respectively，which indicated that the effect of distilled water was better than the latter.Furthermore，the final enyzme activity reached（22.5±0.5）U/mL and（23±0.4）U/mL under methods of distilled water preservation and slant preservation in flask culture system.It showed that distilled water preservation did not reduce the yield of glucose oxidase.Besides，the distilled water preservation compared to slant preservation had some advantages such as execution at room temperature and simply operation.

distilled water preservation；slant preservation；Pichia pastoris

TS201.1

A

1002-0306（2015）12-0201-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.034

2014－09－01

楊晴（1987-），男，在讀碩士研究生，研究方向：微生物酶技術。

李丕武（1970-），男，博士，副教授，研究方向：微生物酶技術。

國家“863”課題（2012AA021504）資助。