四種蛋白酶對牡蠣的酶解效果研究

馮丹丹，馮金曉，薛　勇，李兆杰，王玉明，薛長湖

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003）

四種蛋白酶對牡蠣的酶解效果研究

馮丹丹，馮金曉，薛勇*，李兆杰，王玉明，薛長湖

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003）

以太平洋牡蠣（Oxtrea rivularis Gould）為研究對象，研究了四種蛋白酶酶解對太平洋牡蠣的氨基態氮、總酸、礦質元素及?；撬岷康挠绊憽Ｍㄟ^比較酶解過程中總酸和氨基氮含量變化可知，枯草桿菌中性蛋白酶的水解程度最高，其次為風味蛋白酶，木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶的水解程度較低。對酶解過程中酶解液內所含?；撬峒癦n、Cu、Se的研究。結果表明，木瓜蛋白酶酶解液中?；撬岷孔罡?，為4.01mg/mL，風味蛋白酶酶解液中Zn、Cu、Se含量最高，分別為67.40、26.73μg/mL、270.92μg/L。為優化牡蠣酶解工藝條件或以牡蠣為原料制備富硒飲料等提供了理論基礎。

牡蠣，酶解，氨基態氮，牛磺酸，總酸

牡蠣（Oxtrea rivularis Gould），肉肥爽滑，味道鮮美，營養豐富，素有“海底牛奶”之美稱，是我國著名的海產貝類。中國是世界養殖大國，對世界養殖總產量的貢獻率已達70%［1］。牡蠣是一種高蛋白、低脂肪的食品。牡蠣蛋白氨基酸組成完善，嬰幼兒所需的組氨酸和精氨酸含量較高，除20種常見氨基酸外，還含有β-氨基丙酸、γ-氨基丁酸、鳥氨酸、?；撬岬榷喾N游離氨基酸，尤以天然牛磺酸含量豐富。牡蠣還富含鈣、鐵、鋅、錳和硒等礦物質及微量元素，特別是鋅和硒的含量豐富。

近年來牡蠣等水產品的深加工日益受到重視，其中利用生物酶法處理水產動物蛋白是牡蠣深加工的一個重要方面，這種加工途徑既保留了牡蠣原有的生物活性物質，同時又賦予了新的活性成分［2-4］，使牡蠣蛋白生產附加值明顯提高。目前水解動物蛋白常用的蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、枯草桿菌中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶及風味蛋白酶等［5-7］。本文對四種蛋白酶對牡蠣酶解效果及酶解液中?；撬岬任镔|含量隨酶解時間的變化進行研究，為確定太平洋牡蠣的最優酶解工藝提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

太平洋牡蠣樣品購于青島市團島市場；菠蘿蛋白酶（50萬U/g）、木瓜蛋白酶（65萬U/g）南寧龐博生物工程有限公司；風味蛋白酶（500 LAPU/g） 諾維信生物技術有限公司；枯草桿菌中性蛋白酶（20萬U/g，以下簡稱中性蛋白酶）無錫杰能科生物有限公司；其他試劑均為分析純（AR）。

PHS-3S型pH計上海大普儀器有限公司；電動勻漿機國華科技有限公司；721型分光光度計上海精密科學儀器有限公司；AA-6800型原子吸收分光光度計日本島津公司；高速離心機上海安亭科學儀器廠；JJ-精密增力電動攪拌器、79-1型磁力加熱攪拌器常州國華電器有限公司；1100型高效液相色譜儀美國Aglient公司；電感耦合等離子體發射光譜儀北京時代利和科技發展有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1牡蠣基本成分測定

1.2.1.1?；撬岷繙y定方法采用GB/T 5009.169-2003中的高效液相色譜法測定。

1.2.1.2鋅含量測定方法采用GB/T 5009.14-2003的原子吸收光譜法。

1.2.1.3銅含量測定方法采用GB/T 5009.13-2003的原子吸收光譜法。

1.2.1.4硒含量測定方法采用石墨爐原子吸收光譜法。其中無機硒的提取采用水提法［8］。有機硒含量以總硒含量減去無機硒含量計。

1.2.1.5其他礦物質和微量元素含量測定方法采用電感耦合等離子體原子吸收光譜法（ICP-AAS）。

1.2.2牡蠣酶解液的制備取牡蠣肉流水解凍，采用組織搗碎機制備牡蠣肉勻漿，然后取一定量的勻漿，按照1∶1的比例加水，調節體系初始條件為各種酶的最適作用條件，根據底物中的蛋白質含量添加適量的酶，酶解過程中按酶解時間10、30、60、120、180、240、300、360、480min取樣，樣液加熱至90～100℃滅酶10min，冷卻至室溫，靜置，4500×g離心15min，取上清液，-20℃凍藏待測。酶解條件如表1所示。

表1　酶解條件Table 1　Hydrolysis conditions

1.2.3酶解過程中指標的測定

1.2.3.1總酸（以乳酸計）及氨基態氮含量的測定采用中性甲醛電位滴定法，其中酶解時間為10、30、60、120、180、240、300、360min。

1.2.3.2?；撬峒颁\、銅、硒含量的測定同1.2.1。

1.2.4數據分析方法利用SAS 8.1軟件對所得數據進行分析。所有實驗重復三次，最終結果為三個平行實驗結果的平均值。

2　結果與分析

2.1原料牡蠣中基本成分的含量

牡蠣肉中的?；撬帷⒌V物質和微量元素測定結果見表2。?；撬崾且环N人體必需的非蛋白質氨基酸［9］，可以抑制血液中的膽固醇含量，對增強體質，提高工作效率、解除疲勞、恢復視力、改善肝臟功能等有獨特的保健作用。由表1可知，牡蠣肉中含有豐富的?；撬?，其含量達到6.69mg/g。有研究發現，墨魚、元寶蝦、海蟶、蚌蛤、花蛤中?；撬岬暮糠謩e為10.15、4.94、4.67、10.44、22.14mg/g［10］。

表2　牡蠣肉中基本成分含量（以鮮重計）Table 2　Elementary composition of oyster（on wet basis）

牡蠣肉中含有豐富的硒、鎂、鈣、鋅、鐵等礦物質和微量元素，尤其是鈣、鋅、硒含量豐富。鋅和硒對人體而言具有十分重要的生理功能，如抗衰老、抗毒性、抗癌、治療潰瘍、提高食欲和增強組織再生能力等作用［11］。同時，牡蠣肉中也含有少量的鎘等有毒重金屬元素，對此必需有足夠的重視，并在牡蠣加工過程中加以適當的處理。

2.2牡蠣酶解過程中指標的變化

2.2.1牡蠣酶解過程中氨基態氮含量的變化四種蛋白酶酶解液中氨基態氮含量隨酶解時間的變化見圖1。四種蛋白酶酶解液中氨基氮含量均隨酶解時間的延長呈現上升趨勢，在酶解初始的60min內上升趨勢顯著，此時間段氨基態氮含量增加最多的是風味蛋白酶和中性蛋白酶，其酶解液中氨基氮含量從初始的0.100g/100mL分別增加至0.376g/100mL和0.362g/100mL。菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解液中的氨基態氮含量在酶解初始的60min內雖顯著增加，但上升趨勢緩于風味蛋白酶和中性蛋白酶。60min后，四種蛋白酶酶解液中的氨基態氮含量均緩慢增加。酶解至360min時，酶解液中氨基態氮含量較高的是中性蛋白酶0.540g/100mL和風味蛋白酶0.524g/100mL，較低的是木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶，分別為0.354g/ 100mL和0.326g/100mL。

圖1　氨基氮含量隨酶解時間的變化Fig.1　Change of amino nitrogen content during hydrolysis

2.2.2牡蠣酶解過程中總酸含量的變化魚貝類肌肉的酸性組分包括乳酸、丙酸、丙酮酸、草酸、富馬酸、蘋果酸、檸檬酸等，對魚貝類酶解液的感官特性（風味、顏色和香氣）有較大的影響［12］。如乳酸可以提高緩沖能力，對呈味起增強作用［13］。測定四種蛋白酶酶解液中總酸含量隨酶解時間的變化，結果見圖2。四種蛋白酶酶解液中總酸含量在前60min內上升顯著，60min后上升趨勢減緩。酶解至360min時，酶解液中總酸含量最大的是木瓜蛋白酶，為4.91g/L，總酸含量最小的是菠蘿蛋白酶和風味蛋白酶，均為3.51g/L，總體來說酶解過程中四種酶解液中總酸含量相差不大。

大部分牡蠣肉的酸性成分在基本成分酶解的前2h即釋放出來，且含量快速增加，這可是因為牡蠣肉的微觀組織結構已基本被破壞，乳酸菌代謝糖類。隨著自溶水解時間的延長，總酸含量增加變緩、變小，這個階段增加的有機酸可能主要來自微生物生長產酸［12］。

圖2　總酸含量隨酶解時間的變化Fig.2　Change of total acid content during hydrolysis

2.2.3酶解過程中?；撬岷康淖兓；撬崾且环N人體必需的非蛋白質氨基酸［14］，在酶解過程中，蛋白質被分解為多肽和氨基酸，酶解液中氨基酸組成不斷發生變化，牛磺酸含量也不斷改變［9］。對牡蠣酶解過程中酶解液的?；撬岷窟M行測定，結果見圖3。隨酶解時間的延長，牡蠣蛋白的水解程度不斷增大，酶解液中牛磺酸含量也逐漸增加，同樣呈現出增加速度先快后慢的現象。至酶解終點時，木瓜蛋白酶酶解液中牛磺酸含量最高，為4.01mg/mL。其他從高到低依次為中性蛋白酶3.76mg/mL、風味蛋白酶3.58mg/mL、菠蘿蛋白酶3.43mg/mL。

圖3　牛磺酸含量隨酶解時間的變化Fig.3　Change of taurine content during hydrolysis

2.2.4酶解過程中鋅含量的變化由于我國近海水域的富營養化程度不斷加重，牡蠣中的微量元素含量的測定備受關注，對于研究我國近海海域牡蠣中微量元素含量的分布情況有重要的現實意義［15］。牡蠣肉中含有豐富的鐵、鋅、鈣、錳和硒等礦物質和微量元素，具有抗癌、抗衰老、抗毒性等生理功能。對牡蠣酶解過程中酶解液的鋅含量進行測定，結果見圖4。隨酶解時間的延長，牡蠣蛋白的水解程度不斷增大，酶解液中鋅含量也逐漸增加，呈現出增加速度先快后慢的現象。酶解結束時，四種蛋白酶解液中鋅含量相差不大，最高的是風味蛋白酶酶解液67.40μg/mL，最低的是菠蘿蛋白酶酶解液55.34μg/mL，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解液居中。

圖4　鋅含量隨酶解時間的變化Fig.4　Change of Zn content during hydrolysis

2.2.5酶解過程中銅含量的變化銅是人體必需的微量元素［16］，水產動物體內的銅除作為金屬酶組成部分直接參與體內代謝外，還能維持鐵的正常代謝，有利于血紅蛋白合成和紅細胞成熟，同時參與骨形成。對牡蠣酶解過程中酶解液的銅含量進行測定，結果見圖5。隨酶解時間的延長，牡蠣蛋白的水解程度不斷增大，酶解液中銅含量逐漸增加。酶解結束時，四種蛋白酶解液中銅含量相差不大，最高的是風味蛋白酶酶解液26.73μg/mL，最低的是菠蘿蛋白酶酶解液20.23μg/mL，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解液居中。

圖5　銅含量隨酶解時間的變化Fig.5　Change of Cu content during hydrolysis

2.2.6酶解過程中硒含量的變化硒是人體必需的微量元素，硒與疾病發生有著密切關系，特別是心臟病、癌癥、肝病與缺硒有關，同時，過量食用硒也會引起疾?。?7］。對牡蠣酶解過程中酶解液的硒含量進行測定，結果見圖6。四種酶解液中的硒含量隨酶解時間的延長不斷增大，但風味蛋白酶酶解液中的硒含量明顯高于另外三種蛋白酶解液，為270.92μg/L，中性蛋白酶其次，為219.60μg/L，木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶酶解液中硒含量較低，分別為154.88、133.81μg/L。

圖6　硒含量隨酶解時間的變化Fig.6　Change of Se content during hydrolysis

3　結論

本文研究了菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶及中性蛋白酶四種單酶制劑在其較適宜的作用條件下對牡蠣酶解的影響，結果表明枯草桿菌中性蛋白酶的水解度最高，其次為風味蛋白酶，木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶的水解度較低。對酶解過程中酶解液內所含Zn、Cu、Se以及?；撬岬然钚晕镔|的研究。結果表明：牛磺酸含量最高的是木瓜蛋白酶酶解液，Zn、Cu、Se含量最高的是風味蛋白酶酶解液。

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Effect of four kinds of protease on pacific oyster in the process of enzymatic hydrolysis

FENG Dan-dan，FENG Jin-xiao，XUE Yong*，LI Zhao-jie，WANG Yu-ming，XUE Chang-hu
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

The effects of four kinds of protease enzymatic on pacific oyster during enzymatic hydrolysis on the content of amino nitrogen，total acid，mineral elements and the influence of the content of taurine were studied. The changes of total acid hydrolysis process and amino nitrogen showed that Bacillus subtilis neutral protease induced the highest degree of enzymatic hydrolysis，followed by flavourzyme，hydrolysis papain and bromelain. The changes of taurine and Zn，Cu，Se in enzymatic hydrolysate during hydrolysis was studied.The results showed that the contents of taurine were maximum in Papain enzymatic hydrolysate，4.01mg/mL and the contents of Zn，Cu，Se were maximum in flavor proteinase enzymatic hydrolysate，67.40，26.73μg/mL，270.92μg/L respectively.The results of this investigation may provide a scientific basis for the optimizing the enzymatic hydrolysis process conditions or oyster oysters raw material for the preparation of seleniumm-enriched drinks. Key words：pacific oyster；enzymatic hydrolysis；amino nitrogen；taurine；total acid

TS201.1

A

1002-0306（2015）12-0189-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.031

2014－09－09

馮丹丹（1990-），女，碩士研究生，研究方向：水產品加工與貯藏。

薛勇（1976-），男，副教授，研究方向：水產品加工與貯藏。