工業化釀造過程中酵母分泌蛋白酶A的規律及影響因素的研究

董倩倩，張彥青，李惠萍，李　　紅，房慧婧，杜金華

（1.山東農業大學食品科學與工程學院，山東泰安271018；2.廣州珠江啤酒股份有限公司，廣東廣州510308；3.中國食品發酵工業研究院，北京100027）

工業化釀造過程中酵母分泌蛋白酶A的規律及影響因素的研究

董倩倩1，2，張彥青2，3，李惠萍2，李紅1，3，房慧婧2，杜金華1，*

（1.山東農業大學食品科學與工程學院，山東泰安271018；2.廣州珠江啤酒股份有限公司，廣東廣州510308；3.中國食品發酵工業研究院，北京100027）

對啤酒工業化規模發酵過程中酵母分泌蛋白酶A的規律進行了探討，對酵母代數及酵母貯存條件等因素對酵母分泌蛋白酶A的影響進行了研究，并對蛋白酶A活性不同的成品純生啤酒的泡持值、泡沫活性蛋白含量及蛋白酶A活性進行了跟蹤分析。結果表明：發酵過程中，蛋白酶A的活性呈上升趨勢且接種酵母的蛋白酶A活性越高，與其對應的發酵液中蛋白酶A的活性越高，成品酒的泡沫穩定性越差。另外，隨著酵母代數及貯存時間的增加，酵母分泌蛋白酶A的量增加。當酵母蛋白酶A活性控制在0.015U/mL以下且成品酒的初始蛋白酶A活性在15×10-5U/mL以下時，儲存4個月的成品純生啤酒的泡沫穩定性較好。

啤酒，蛋白酶A，泡沫，酵母，釀造

啤酒是一種以麥芽、水為主要原料，加啤酒花（包括酒花制品），經酵母發酵釀制而成的、含有二氧化碳的、起泡的、低酒精度的發酵酒。純生啤酒則是應用微孔膜過濾及無菌罐裝技術得到的新鮮、爽口、口感純正的啤酒。自推出后，以其獨有的新鮮口感贏得了各國消費者的青睞。隨著純生啤酒產量的迅速增長，我國純生啤酒的質量在不斷地提高，但作為評判純生啤酒品質之一的泡沫穩定性卻一直困擾著啤酒釀造者們，即隨著貨架期的延長，純生啤酒的泡沫穩定性逐漸降低。

國內外研究表明［1-6］，純生啤酒中含有大量有助于泡沫穩定性的組分：泡沫活性蛋白或多肽、二氧化碳、非淀粉多糖、金屬離子、異-α-酸等。其中，泡沫活性蛋白和多肽對泡沫穩定性具有重要作用，主要包括蛋白質Z和脂轉運蛋白LTP1［7］。而酵母在發酵過程中產生的蛋白酶A則是作用于蛋白質Z和脂肪轉運蛋白（LTP1）的主要蛋白酶類［8］。它在發酵階段和酒體成熟階段被釋放到酒液中，消化有助于啤酒泡沫穩定性的蛋白質，改變蛋白質Z和脂肪轉運蛋白LTP1的疏水性能［9-10］。另外，由于純生啤酒未經巴氏殺菌，殘留在成品純生啤酒中的蛋白酶A會繼續破壞這些蛋白質和多肽［11］，使處于貯存或貨架期的純生啤酒的泡沫穩定性降低，影響純生啤酒的品質。因此，控制好釀造過程中酵母蛋白酶A的分泌對提高純生啤酒的品質至關重要。

在啤酒生產過程中，影響酵母分泌蛋白酶A的因素主要有酵母活力、酵母接種量、氮源、輔料及原麥汁濃度等。其中輔料的增加［12］、原麥汁濃度的增加［13］、氮源缺乏［14-15］以及過高酵母接種量［16］均會導致發酵液中蛋白酶A活性的增加。研究表明：在這些因素中，酵母菌株的活力對蛋白酶A活性的影響更大一些［17］。因此，本實驗對酵母及純生啤酒生產過程中的蛋白酶A活性及發酵過程和成品純生的泡持值、泡沫活性蛋白含量及蛋白酶A活性進行了跟蹤分析。旨在明確酵母分泌蛋白酶A的規律及影響其分泌的主要因素，為工業化啤酒生產過程中的酵母菌種管理及發酵過程控制提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

P酵母（啤酒酵母）由國內某大型啤酒集團公司提供；考馬斯亮藍G-250國藥集團化學試劑有限公司；牛血清蛋白（含氮量≥13.5%） 上海伯奧生物科技有限公司；無水乙醇安徽安特食品股份有限公司；磷酸廣州市東紅化工廠；Na2HPO4·12H2O、檸檬酸廣州化學試劑廠；二甲基亞砜（DMSO） FARCO化學試劑公司；蛋白酶KSigma公司；熒光底物MOCAc-Ala-Pro-Ala-Lys-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys（Dnp）-NH2日本多肽研究所。

Nibem-T Haffman泡沫測定儀荷蘭Haffmans公司；LRH-250A生化培養箱廣東省醫療器械廠；V3140型紫外分光光度計澳大利亞GBC公司；RF-5301PC熒光分光光度計日本東京島津公司；HHW21-420 XMTB數顯調節恒溫水浴鍋余姚市東方電工儀器廠；HI8417pH計Hanna公司；MEDIFRIGERBL型冷凍離心機西班牙J P SELECTA公司。

1.2實驗方法

1.2.1樣品前處理冷麥汁用單層濾紙過濾后備用；酵母泥及發酵液樣品離心（5℃，5000r/min，20min）取上清液備用；成品純生啤酒樣品振蕩（240r/min，30min）除氣備用。

1.2.2蛋白酶A活性檢測見參考文獻［18-20］。

1.2.3泡沫活性蛋白的檢測見參考文獻［20-21］。

1.2.4泡持性的測定參照國標GB/T 4928-2008中的儀器法測定啤酒泡持性。每次各取兩瓶測定，取其平均值。

1.2.5酵母泥檢測對純生啤酒釀造時常用的1～3代P酵母分泌蛋白酶A的情況進行跟蹤分析。實驗取1～3代酵母各5株，并對各代酵母編號為1#～5#（即1代酵母1#～5#，2代酵母1#～5#，3代酵母1#～5#），檢測它們的蛋白酶A活性，探索酵母分泌蛋白酶A的規律。

1.2.6發酵過程及成品純生啤酒分析本實驗跟蹤檢測了28個發酵罐（500t，13°P發酵液）所用酵母泥及發酵液的蛋白酶A活性和泡沫活性蛋白含量，并對其所得成品純生啤酒（10°P）4個月內的泡持值、泡沫活性蛋白含量及蛋白酶A活性進行了跟蹤分析。通過分析，本文選取了6個具有代表性的發酵罐（罐號為09#、14#、28#、29#、45#、45′#），對其檢測數據進行分析以闡明純生啤酒發酵過程中蛋白酶A的分泌規律及不同蛋白酶A活性對啤酒泡沫穩定性的影響。

2　結果與分析

2.1酵母代數與蛋白酶A分泌量的關系

酵母菌的生長繁殖過程遵循幼-壯-老-衰-死的生長規律，不同代數的酵母菌株所處的生理狀態不同，對啤酒的發酵也會有不同的影響［22］。啤酒工業化生產過程中，同一品種的純生啤酒所使用的釀造工藝和酵母菌種是相同的，但是由于酵母代數不同，會影響啤酒泡沫穩定性，最終導致不同批次的成品啤酒質量千差萬別［23］。

圖1　同種酵母不同代數酵母泥上清液的蛋白酶A活性Fig.1　Proteinase A activity from generations of brewer’s yeast

本實驗對工業釀造純生啤酒常用的1～3代P酵母分泌蛋白酶A的情況進行了跟蹤分析。圖1為不同代數酵母泥的上清液蛋白酶A活性。由圖1可以看出：隨著酵母代數的增加，其分泌的蛋白酶A量增加，5株1代P酵母的蛋白酶A活性均在0.015U/mL以下，5株3代P酵母的蛋白酶A活性均較高，而2代酵母的蛋白酶A活性則有高有低。

通過對蛋白酶A活性變化較大的5株2代P酵母的發酵參數（表1）分析可知：這5株酵母的存活率及發酵液的酵母接種量差別不大，因此其中3#的蛋白酶A的活性較高是由于酵母回收時間及酵母來源所致。分析原因為在啤酒釀造后期，酵母自然沉降到罐底，此時發酵液中營養物質耗盡，酵母發酵結束，而且發酵罐底部降溫困難，溫度升高，因此延長酵母在大罐內的貯存時間將會導致酵母老化自溶，酵母細胞膜損傷，蛋白酶A被釋放進入酒液［24-25］。另外，2代酵母的4#和5#酵母均來自高濃發酵，由于酵母在接種前處于高滲透壓和高酒精度的環境中，導致酵母褶皺、內陷，在接種時酵母泥本身的蛋白酶A活性較高以至于在后續發酵過程中蛋白酶A活性始終處于較高水平。因此，在進行酵母接種前，除了考慮酵母的存活率外也應該檢測酵母泥的上清液蛋白酶A活性，而且對于已經用于高濃發酵或回收較晚的酵母（即使為1～3代酵母）以及酵母的蛋白酶A活性超過0.015U/mL時應不予以考慮進行純生啤酒的釀造。

表1　2代酵母的發酵參數Table 1　Parameters of fermentation used second-generation yeast

2.2酵母貯存時間對其分泌蛋白酶A的影響

酵母的貯存條件，如貯存周期、壓力、溫度都會對酵母的活性產生不同程度的影響，特別是蛋白酶A的分泌。本實驗的酵母貯存溫度及壓力基本一致（數據未顯示），因此只跟蹤了酵母在貯罐內的貯存情況（見圖2）。

圖2　不同酵母貯存時間下酵母蛋白酶A的分泌增加量Fig.2　Increasing proteinase A activity by yeast in different storage period

由此發現：隨著酵母貯存周期的延長，蛋白酶A的分泌量呈上升趨勢。酵母在貯存2～3d后，其蛋白酶A活性增加量在0.004U/mL以下。但是貯存5d后，酵母蛋白酶A活性急劇增加，達到0.012U/mL，比剛回收到酵母貯罐的酵母的蛋白酶A活性增加了2倍多。這表明即使在低溫下貯存酵母，酵母分泌蛋白酶A的量仍然會發生很大變化。因此，在實際生產中，要加強對接種酵母的檢測和管理，在使用較低代數酵母的同時盡可能保證酵母回收后的盡快使用。

2.3發酵過程中蛋白酶A活性及泡沫活性蛋白含量的變化

對6罐由不同代數酵母所釀造的純生啤酒各階段（酵母泥上清液、回收酵母后的發酵液、成熟發酵液、生啤、成品純生啤酒）蛋白酶A活性及泡沫活性蛋白含量進行了跟蹤檢測。

表2　各發酵罐所接種酵母的代數Table 2　Generation of yeast in fermenter

圖3　啤酒釀造各階段的蛋白酶A活性Fig.3　Proteinase A activity during fermentation

結合表2和圖3發現：當酵母代數較高（45′#）或酵母泥的蛋白酶A活性較高（09#）時，整個發酵過程中蛋白酶A活性呈現先上升后下降趨勢。另外，即使酵母泥的蛋白酶A活性相差不多（圖3中14#、29#），其發酵過程中的蛋白酶A活性變化也會因酵母代數的不同而不同。

圖4　釀造過程中泡沫活性蛋白含量變化Fig.4　Changes of foam protein content during fermentation

圖4則是不同代數酵母所釀造啤酒的各階段泡沫活性蛋白含量的變化趨勢，其中45′#、28#和09#發酵罐的麥汁泡沫活性蛋白含量較高，其次為45#、29#、14#。但是在發酵結束后，28#、09#發酵罐的泡沫活性蛋白含量較低，結合圖3能夠看出28#和09#發酵過程中的蛋白酶A活性較高，在整個發酵過程中降解泡沫活性蛋白較多，所以它們的泡沫活性蛋白含量偏低。

2.4蛋白酶A活性與啤酒泡沫穩定性的關系（成品跟蹤情況）

為了探究蛋白酶A活性與啤酒泡沫穩定性的關系，對蛋白酶A活性不同的成品純生啤酒進行室溫貯存并跟蹤它們在4個月內泡持值、泡沫活性蛋白含量及蛋白酶A活性的變化規律（見表3，圖5～圖7）。

由圖5可知，雖然這些成品啤酒泡持初始值相差不多，均在235S左右，但是常溫貯存半月后，每個罐的泡持值存在明顯的區別，且在2個月后它們的泡持值大部分低于200S。

表3　各罐發酵參數Table 3　Parameters of fermentation

圖5　4個月內成品純生啤酒的泡持值Fig.5　Changes of foam stability in 4 months

圖6中成品純生啤酒貯存4個月后，泡持值低的45′#和28#罐的泡沫活性蛋白含量下降了40%～50%，而泡持值高的29#和14#罐則下降了30%左右，其他發酵罐下降30%～40%。

圖6　成品貯存過程中泡沫蛋白的變化Fig.6　Changes of foam protein content during draft beer storage period

圖7中，發酵罐45′#的成品啤酒蛋白酶A活性最高，在貯存期的前半月呈上升趨勢，隨后不斷下降；而28#在貯存過程中始終呈現上升趨勢；其他成品蛋白酶A活性則隨著貯存期的延長而不斷減弱，衰減主要發生在前2個月。根據Kondo等［18］的研究結果推斷：這一現象與蛋白酶A的動力學特性及蛋白酶A前驅物有關，即酵母胞外滲出的蛋白酶A最初在酒液中是以無活性的蛋白酶A前驅物存在。由于純生啤酒的酸性環境［18］及常溫貯存（接近蛋白酶A的最適溫度）非常適宜蛋白酶A由無活性的前驅物向有活性的蛋白酶A轉化，因此在貯酒階段會出現蛋白酶A活性升高或泡持性持續衰減的現象。但是對于這種轉化機理只處于猜測階段，目前并無文獻證明這一推斷，還需要進一步探究。

圖7　4個月內成品純生啤酒的蛋白酶A活性Fig.7　Changes of the proteinase A activity of draft beer in 4 months

綜上所述，純生啤酒泡持值的衰減存在一定規律性：在貯存的前2個月，泡持衰減的速度最快，而且此階段酒體中蛋白酶A的活性較高；2個月后，泡沫穩定性衰減的速度趨于平緩，甚至消失。另外，每個發酵罐所接種酵母的代數及其蛋白酶A活性不同，其發酵得到的純生啤酒中蛋白酶A活性也不同。由于蛋白酶A對泡沫活性蛋白的降解作用，導致了貯存期間泡沫活性蛋白含量的下降，而且蛋白酶A活性越高，成品啤酒的泡沫活性蛋白含量的下降趨勢越明顯，從而導致其泡持值較快的衰減速率而且在4個月內一直維持這種趨勢。

圖8　純生啤酒蛋白酶A活性與泡沫穩定性的關系Fig.8　Correlation between the amount of proteinase A in beer and foam stability

根據上述結論，本實驗跟蹤檢測了不同蛋白酶A酶活（0～50×10-5U/mL）的純生啤酒在室溫貯存2個月后的泡持值如圖8所示，檢測結果表明：泡持值的減少與初始蛋白酶A含量的多少成一定比例。蛋白酶A的酶活越高（當超過15×10-5U/mL時），這種趨勢就越明顯。因此，如果降低成熟發酵液的蛋白酶A酶活（≤25×10-5U/mL），并控制成品初始蛋白酶A活性低于15×10-5U/mL，純生啤酒的泡沫穩定性將會得到改善。

3　結論

對酵母分泌蛋白酶A的規律及其影響因素進行了探討，分別從酵母代數、酵母貯存時間、發酵過程中蛋白酶A活性變化規律及蛋白酶A含量不同的純生啤酒貯存期變化趨勢等四個方面分析了蛋白酶A對純生啤酒泡沫穩定性的影響。結果表明：使用1～2代的酵母并將接種酵母、成熟發酵液及成品純生初始的蛋白酶A活性分別控制在0.015、25×10-5、15× 10-5U/mL時，純生啤酒的泡沫穩定性可以得到明顯的改善。

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Study on the rules and influencing factors of yeast proteinase A secretory under industrial scale brewing

DONG Qian-qian1，2，ZHANG Yan-qing2，3，LI Hui-ping2，LI Hong1，3，FANG Hui-jing2，DU Jin-hua1，*
（1.College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018，China；2.Guangzhou Zhujiang Brewery Co.，Ltd.，Guangzhou 510308，China；3.China National Research Institute of Food&Fermentation Industries，Beijing 100027，China）

The secretory regularity of proteinase A from yeast was investigated in industrial scale fermentation. The factors such as yeast generation and storage conditions were studied to achieve their influencing extent of yeast proteinase A excretory，and the change of proteinase A activity，foam protein and head retention of draft beer with different initial proteinase A level during storage were tested in this study.The results showed that the activity of proteinase A would increase during fermentation，and the tendency was pronounced for fermenting worts while the generation of yeasts was increased.In addition，with the increase of storage period，the concentration of proteinase A excreted from yeast cells also increased.When the activity of proteinase A by yeast was below 0.015U/mL and the initial proteinase A activity in final product was less than 15×10-5U/mL，the foam stability of draft beer would be better than others after 4 months.

beer；proteinase A；foam；yeast；brewing

TS261.1

A

1002-0306（2015）12-0157-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.024

2014－09－10

董倩倩（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品科學。

杜金華（1963-），女，博士，教授，研究方向：食品微生物與釀酒技術。

廣州市海珠區科技計劃項目（2013-ZD-01）；國家國際科技合作專項（2014DFG31770）。