乙醇脅迫對啤酒酵母生長及蛋白表達的影響

何英英，尹　　花，繆錦來，杜　　寧，鄭　　洲，*

（1.啤酒生物發(fā)酵工程國家重點實驗室，山東青島266061；2.國家海洋局生物活性物質(zhì)重點實驗室，山東青島266061）

乙醇脅迫對啤酒酵母生長及蛋白表達的影響

何英英1，2，尹花1，+，繆錦來2，杜寧2，鄭洲2，*

（1.啤酒生物發(fā)酵工程國家重點實驗室，山東青島266061；2.國家海洋局生物活性物質(zhì)重點實驗室，山東青島266061）

研究了乙醇脅迫對啤酒酵母生長的影響，應(yīng)用光鑷拉曼光譜（LTRS）技術(shù)獲得并分析酵母單細胞拉曼光譜，從分子水平分析釀酒酵母細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)組變化。結(jié)果表明乙醇可抑制酵母生長，隨著乙醇濃度的提高，酵母細胞直徑變小、穩(wěn)定期推遲、生物量和蛋白質(zhì)含量也呈減少趨勢；通過光鑷拉曼光譜分析可了解酵母細胞內(nèi)的乙醇濃度和生化組成的相對含量等信息；在不同乙醇濃度下，采用SDS變性凝膠電泳（SDS-PAGE）共檢測到22個明顯的差異條帶，并對其中7個差異條帶進行質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)這7個差異蛋白的功能主要與端粒穩(wěn)定性、細胞自溶及代謝相關(guān)；不同乙醇濃度可誘導(dǎo)酵母特定蛋白質(zhì)表達發(fā)生變化，如HSP104等蛋白質(zhì)，說明這些蛋白質(zhì)所參與的代謝途徑在啤酒酵母乙醇耐性中具有普遍作用。

啤酒酵母，乙醇脅迫，蛋白質(zhì)組

啤酒因其具有的營養(yǎng)和保健作用而備受人們推崇，是當前最受歡迎的飲料之一。啤酒酵母的生物學(xué)特性是決定啤酒質(zhì)量和特色的重要因素之一，直接決定著啤酒的特點、風(fēng)味及質(zhì)量。啤酒廠家高度重視啤酒酵母的質(zhì)量控制，把啤酒酵母的優(yōu)化、選育工作放在極其重要的位置。在啤酒高濃度發(fā)酵時，高濃度底物相應(yīng)地也會生成較高濃度的酒精，過高的酒精濃度對酵母有毒性，會抑制細胞的生長及發(fā)酵活性，酵母的發(fā)酵能力在很大程度上取決于其自身酒精耐受力的大小［1-2］，釀酒酵母對生理脅迫的耐受機理一直是研究者們研究的熱點。隨著科技進步，諸如蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等一些新技術(shù)已被逐漸應(yīng)用于釀酒酵母對乙醇耐受性及相關(guān)問題的研究［3-4］，這將極大促進人們對釀酒酵母乙醇耐受性方面的相關(guān)研究。

目前高濃度發(fā)酵是啤酒工業(yè)的主要工藝。盡管啤酒酵母對酒精的耐受力很強，但還是有一個乙醇的耐受力極限，超過一定的限度時，乙醇對啤酒酵母就有毒害作用。乙醇對啤酒酵母的影響是啤酒質(zhì)量控制關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，但乙醇含量對啤酒酵母生長及蛋白表達影響的研究較少。王祥余等建立了釀酒酵母胞外和胞內(nèi)蛋白雙向電泳圖譜制作方法，趙紹輝等完成了釀酒酵母蛋白質(zhì)雙向電泳條件優(yōu)化及圖譜建立，但均未對差異蛋白進行分析［5-6］。本文以啤酒酵母為對象，研究了乙醇對啤酒酵母生長和體內(nèi)蛋白表達的影響，并應(yīng)用光鑷拉曼光譜技術(shù)（laser tweezers Raman spectroscopy，LTRS）獲得酵母單細胞拉曼光譜，以期為啤酒酵母的優(yōu)選和發(fā)酵提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

啤酒酵母菌株國家海洋局海洋活性物質(zhì)重點實驗室保存；YPD培養(yǎng)基酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g，加水至1000mL；無水乙醇、碳酸氫銨、鹽酸均購自北京化工廠；小牛血清白蛋白、蛋白Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；考馬斯亮藍R-250、乙腈、胰蛋白酶（250U/mg）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、三氟乙酸均購自Amresco公司；丙烯酰胺、β-巰基乙醇、十二烷基磺酸鈉（SDS）、二硫蘇糖醇（DTT） 均購自Amersham Pharmacia Biotech公司。

YXQ-LS-50S立式壓力蒸汽滅菌鍋上海博迅實業(yè)有限公司；PHS-3C雷磁精密pH計上海精密科學(xué)儀器有限公司；超凈工作臺上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；752SP紫外可見光分光光度計上海棱光技術(shù)有限公司；XSZ-3C相差顯微鏡上海博迅實業(yè)有限公司；TGL-16B臺式離心機上海安亭科學(xué)儀器廠；2-16K高速冷凍離心機德國Sigma公司；PAC1000電泳儀BIO-RAD；FluorChem5500紫外分析儀Alpha Innotech；激光鑷子拉曼光譜系統(tǒng)廣西科學(xué)院；ABI 4700基質(zhì)輔助激光解吸離子飛行時間質(zhì)譜儀美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞大小的測定將菌種接入液體培養(yǎng)基中，30℃、170r/min培養(yǎng)18h（對數(shù)期）進行活化，然后分別轉(zhuǎn)接到乙醇濃度為0%、2.5%、5%、7.5%、10%、15%的搖瓶中培養(yǎng)（30℃、170r/min），分別在1h（延滯期）、8h（對數(shù)期）和16h（穩(wěn)定期）時取樣，在顯微鏡下根據(jù)標尺測量啤酒酵母細胞大小。

1.2.2生長曲線的測定將菌種接入液體培養(yǎng)基中，30℃、170r/min，培養(yǎng)18h（對數(shù)期）進行活化，然后分別轉(zhuǎn)接到乙醇濃度為0%、2.5%、5%、7.5%、10%、15%的搖瓶中培養(yǎng)（30℃、170r/min），每隔1h取樣，測OD600。

1.2.3單細胞拉曼光譜測定收集培養(yǎng)20h后的啤酒酵母細胞，利用激光鑷子拉曼光譜系統(tǒng)采集和分析其拉曼光譜，實驗條件是激光波長780nm，激光功率10mW，光譜收集時間20s。所有數(shù)據(jù)均以ASCII形式輸入Micro Origin 7.0進行統(tǒng)計分析。為獲得每個樣品的平均光譜，在樣品內(nèi)部每個細胞的拉曼光譜先減去其各自背景光譜后進行平均，然后進行相鄰五點平滑處理。

1.2.4啤酒酵母蛋白的提取發(fā)酵液離心（4℃、12000×g離心10min）收集菌體，用0.85%NaCl溶液離心（4℃、12000×g離心10min）洗滌兩次，棄上清液；按1∶3（v/v）加SDS提取液（64mmol/L Tris-HCl，10%甘油，2%SDS，5%β-巰基乙醇），對菌體進行液氮研磨破碎菌體，每次研磨5min，研磨兩次；再進行超聲波破碎（超聲3s，間隙3s，全程2min，功率600W）；12000r/min、4℃冷凍離心10min，取上清-20℃?zhèn)溆茫坏鞍踪|(zhì)含量采用Bradford法測定［7］，用小牛血清白蛋白（BSA）作標準蛋白。

1.2.5SDS-PAGE采用Laemmli法［8］，分離膠為15%的丙烯酰胺，濃縮膠為5%的丙烯酰胺，恒流先以4mA電泳、進入分離膠后再以10mA電泳，完成后剝離膠用考馬斯亮藍R-250進行染色。采用紫外分析儀進行圖像采集，并用配套軟件Alpha 2200對SDS-PAGE圖譜進行條帶的采集和分析。

1.2.6蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定用干凈的刀片將蛋白條帶從膠上切割下來，放入1.5mL的離心管內(nèi)，加少量的雙蒸水后將離心管放入4℃冰箱保存。將膠塊清洗幾次后用50%乙腈-50mmol/L碳酸氫銨（pH8.0）溶液浸泡膠塊，振蕩20min后棄去溶液，重復(fù)1～2次至膠塊中顏色褪盡；用100%乙腈100μL對膠進行干燥，然后移去其中的乙腈，將膠塊放入37℃烘箱中5～10min；加入5～10μL濃度12.5ng/μL的胰蛋白酶溶液，4℃冰箱中約30min，取出后在37℃烘箱中酶解過夜；50%乙腈-0.1%三氟乙酸60μL處理30～40min后，將溶液轉(zhuǎn)移到新的96孔板內(nèi)，重復(fù)2～3次。將肽段溶液在N2氣流下吹干濃縮，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF-MS/MS）的質(zhì)譜方法進行鑒定。

表1　啤酒酵母細胞直徑（μm）Table 1　The cell diameter result of S.cerevisiae protein（μm）

2　結(jié)果與分析

2.1不同濃度乙醇對啤酒酵母細胞形態(tài)的影響

在不同濃度乙醇作用下，乙醇濃度越高啤酒酵母菌體直徑越小（表1）；而且隨著乙醇濃度的增大，細胞形態(tài)也發(fā)生一定的改變，乙醇濃度高時細胞呈橢圓形（15%時尤其明顯）（圖1）。這是乙醇脅迫下啤酒酵母細胞的表觀反應(yīng)，也說明乙醇的存在對酵母細胞的生長起抑制作用。

圖1　不同濃度乙醇對啤酒酵母細胞形態(tài)的影響（10×40）Fig.1　Effect of different concentrations of ethanol on the morphology of S.cerevisiae（10×40）

2.2不同濃度乙醇對啤酒酵母生長的影響

隨著乙醇濃度的提高，酵母達到穩(wěn)定期時的生物量明顯減少，而且穩(wěn)定期逐漸推遲（圖2）。在沒有乙醇的培養(yǎng)條件下，酵母細胞在2h時進入對數(shù)期，10h時基本達到穩(wěn)定期，18h時出現(xiàn)了二次生長現(xiàn)象。在2.5%乙醇培養(yǎng)下的酵母細胞，生長曲線趨勢基本與無乙醇時一致，只是細胞數(shù)量有所減少。在5%乙醇脅迫下，酵母細胞在5h左右進入對數(shù)期，進入穩(wěn)定期的時間也有所推遲，大約在13h左右。在7.5%乙醇的脅迫下，細胞停留在遲滯期的時間進一步延長，6h時才進入對數(shù)期，15h左右進入穩(wěn)定期。在10%乙醇下，該現(xiàn)象更加明顯，7h達到對數(shù)期，17h進入穩(wěn)定期，二次生長現(xiàn)象不明顯，細胞數(shù)量明顯減少，證明乙醇脅迫下細胞生長受到抑制。

圖2　不同濃度乙醇對酵母細胞生長的影響Fig.2　Effect of different concentrations of ethanol on the growth of S.cerevisiae

2.3不同濃度乙醇對啤酒酵母細胞蛋白質(zhì)含量的影響

由圖3可以看出，隨著培養(yǎng)時間的增長，啤酒酵母細胞的總蛋白含量逐漸增加；而隨著培養(yǎng)時加入乙醇含量的增高，蛋白量呈減少趨勢，這種減少趨勢與乙醇脅迫下的啤酒酵母生長曲線的變化趨勢一致。

圖3　不同濃度乙醇對酵母細胞蛋白質(zhì)含量的影響Fig.3　Effect of different concentrations of ethanol on the protein content of S.cerevisiae

2.4啤酒酵母單細胞拉曼光譜分析

LTRS是將光學(xué)囚禁技術(shù)與顯微拉曼光譜技術(shù)相結(jié)合用于單細胞探測的新技術(shù)［9］，應(yīng)用LTRS系統(tǒng)得到啤酒酵母單細胞的平均拉曼光譜（圖4），光譜曲線反映了細胞內(nèi)的生化組成及其相對含量。圖4中有蛋白質(zhì)、脂類、DNA、糖類和乙醇等對應(yīng)的信號峰［10-11］；其中881cm-1峰對應(yīng)是乙醇，峰強顯示發(fā)酵后的乙醇濃度接近8%。因此，可通過實時觀察單個細胞的生物化學(xué)過程，分析拉曼光譜特征峰的位置、強度等可以獲知掩蓋在群體平均信息下的個體生命信息和實時生命物質(zhì)變化的信息，從而有效地了解細胞的真實生理變化。

圖4　啤酒酵母的平均拉曼光譜圖Fig.4　Mean Raman spectrum of single S.cerevisiae

2.5蛋白質(zhì)譜分析

不同時期、不同濃度乙醇脅迫下的啤酒酵母細胞蛋白質(zhì)SDS-PAGE見圖5，可見其蛋白表達具有差異，其中22個酵母蛋白條帶表達差異明顯；且不同乙醇濃度可誘導(dǎo)酵母相同蛋白質(zhì)表達發(fā)生變化，如蛋白條帶4，說明這些蛋白質(zhì)所參與的代謝途徑在啤酒酵母乙醇耐性中具有普遍作用。選取7個差異比較明顯的條帶（編號依次為1～7）進行質(zhì)譜鑒定，結(jié)果如表2所示，其中5個蛋白與啤酒酵母應(yīng)激乙醇脅迫有關(guān)。

表2　啤酒酵母蛋白質(zhì)肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定結(jié)果Table 2　Peptide mass fingerprinting appraisal result of S.cerevisiae protein

圖5　啤酒酵母蛋白電泳Fig.5　Protein profile of S.cerevisiae on 15%SDS-PAGE

蛋白條帶1：Yef3p是一種重要的蛋白質(zhì)，具有維持端粒結(jié)構(gòu)的作用，它在細胞受到營養(yǎng)物質(zhì)而脅迫時，會引導(dǎo)細胞進行最優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄，它還與核糖體的作用相關(guān)聯(lián)，并涉及酵母細胞生長的中樞控制因子TOR（target of rapamycin）信號通路，外界營養(yǎng)因素可通過TOR信號通路的作用控制酵母細胞的生長［12］。

蛋白條帶2：纈氨酰-tRNA合成酶（valyl-tRNA synthetase）的作用主要是催化如下反應(yīng)［13］：ATP+L-valine+tRNA（Val）=AMP+diphosphate+L-valyl-tRNA（Val）。說明酵母在乙醇脅迫的過程中，細胞對纈氨酸的利用大幅上調(diào)與應(yīng)對乙醇脅迫相關(guān)。

蛋白條帶3：異亮氨酸-tRNA合成酶（isoleucyltRNA synthetase）它具有兩方面的作用，一方面它作為異亮氨酸合成酶；另一方面它是Reveromycin A特定的抑制位點，而Reveromycin A會導(dǎo)致細胞自溶［14］。

蛋白條帶4：熱激蛋白104（heat shock protein 104，HSP104）可能作為一種通用的保護蛋白質(zhì)，在酵母細胞受到生理脅迫時進行過量表達［15］。它的作用很可能讓瀕臨逆境脅迫的酵母細胞逐漸適應(yīng)新的環(huán)境而得以繼續(xù)生存。

蛋白條帶5：乙酰轉(zhuǎn)移酶（acetyl transferase）是酵母細胞中一類重要的蛋白質(zhì)，它參與酵母細胞中半數(shù)以上蛋白質(zhì)N末端的乙酰基化［16］。乙酰轉(zhuǎn)移酶活性是發(fā)酵過程中影響酯類生成的最重要的因素，與啤酒的風(fēng)味密切相關(guān)。

蛋白條帶6：ATP結(jié)合蛋白（ATP binding protein）與蛋白質(zhì)的折疊以及向液泡轉(zhuǎn)送蛋白質(zhì)相關(guān)，它還與分子伴侶的T復(fù)合物相關(guān)，在細胞質(zhì)、液泡及細胞壁中都有出現(xiàn)［17］。

蛋白條帶7：丙酮酸脫羧酶（pyruvate decarboxylase isozyme）是釀酒酵母代謝途徑中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，它催化的反應(yīng)是利用丙酮酸生成乙醛，其活性直接影響釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)物。

3　結(jié)論

乙醇可抑制啤酒酵母細胞生長，隨著乙醇濃度的提高，酵母細胞的直徑變小，酵母達到穩(wěn)定期時的生物量明顯減少，穩(wěn)定期逐漸推遲，蛋白質(zhì)含量也呈減少趨勢。利用LTRS技術(shù)獲得了酵母細胞內(nèi)的乙醇濃度和生化組成的相對含量，可通過實時觀察單個酵母細胞的生物化學(xué)過程，更有效地了解酵母細胞的真實生理變化。在不同乙醇濃度下，采用SDS-PAGE檢測到22個表達差異條帶，并對其中7個進行質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)其蛋白的功能主要與端粒穩(wěn)定性、細胞自溶及各種關(guān)鍵代謝有關(guān)。不同乙醇濃度可誘導(dǎo)酵母特定蛋白質(zhì)表達發(fā)生變化，如HSP104等蛋白質(zhì)，說明這些蛋白質(zhì)所參與的代謝途徑在啤酒酵母乙醇耐性中具有普遍作用，可為啤酒酵母的優(yōu)選和發(fā)酵提供科學(xué)依據(jù)。

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圖6　超聲波處理對矢車菊素在β-胡蘿卜素-亞油酸體系中的抗氧化活性影響Fig.6　Effectofultrasonictreatmentonthetheantioxidantactivities of cyanidin measured by β-carotene-linoleic acid system

3　結(jié)論

隨著超聲波處理時間的延長、功率增大，桑葚中花色苷矢車菊素的穩(wěn)定性顯著（p＜0.05）降低，即超聲波會使花色苷發(fā)生降解，抗氧化能力降低，整個溶液體系的FRAP和DPPH均下降。由于花色苷具有多種對人體有利的生理功能，而超聲波在加工應(yīng)用中會降低花色苷的穩(wěn)定性，造成其部分降解，降低商品價值，因此為降低其對花色苷的破壞程度，應(yīng)盡量選用低功率，短時間處理。

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Effect of ethanol stress on the growth and protein expression of Saccharomyces cerevisiae

HE Ying-ying1，2，YIN Hua1，+，MIAO Jin-lai2，DU Ning2，ZHENG Zhou2，*
（1.State Key Laboratory of Biological Fermentation Engineering of Beer，Qingdao 266061，China；2.Key Laboratory of Marine Bioactive Substance，State Oceanic Administration，Qingdao 266061，China）

This paper studied the effect of ethanol stress on the growth situation of Saccharomyces cerevisiae，the Raman spectroscopic of its cells were got and analyzed by laser tweezers Raman spectroscopy（LTRS），and the proteomic changes in its cells were analyzed at the molecular level.The results showed that the ethanol could inhibit yeast growth.With the ethanol concentration increasing，the yeast cell diameter decreased，stable period delay，biomass and protein content also showed a decreasing trend.The relative content of alcohol concentration and biochemical composition in Saccharomyces cerevisiae cells could be obtained used LTRS as tool.22 differential bands were detected in different concentrations of ethanol by SDS-PAGE，of which 7 differential bands were identified by mass spectrometry.The 7 proteins function mainly related to telomere stability，cell autolysis and key metabolic.Different concentrations of ethanol could induce the same protein expression changes，such as HSP104 protein，which indicated the metabolic pathway of these proteins participate play a universal role in yeast ethanol tolerance.

Saccharomyces cerevisiae；ethanol stress；proteome

TS261.1

A

1002-0306（2015）12-0147-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.022

2014－08－29+并列第一作者

何英英（1989-），女，碩士研究生，研究方向：應(yīng)用微生物。尹花（1972-），女，碩士，應(yīng)用研究員，研究方向：發(fā)酵工程。

鄭洲（1978-），男，博士，副研究員，研究方向：應(yīng)用微生物。

國家重點實驗室開放基金（K2012003；K2014003）。