分子生物技術在污水處理系統內硝化菌群研究中的應用

楊浩　刁治民　梁洪興

（1.青海師范大學生命與地理科學學院，青海 西寧 810008； 2.重慶市合川區瑞山中學，重慶 合川 401520）

分子生物技術在污水處理系統內硝化菌群研究中的應用

楊浩1刁治民1梁洪興2

（1.青海師范大學生命與地理科學學院，青海 西寧 810008； 2.重慶市合川區瑞山中學，重慶 合川 401520）

分子生物技術近幾年來得到了飛速發展，廣泛應用于環境微生物的研究，本文詳細介紹了最近幾年研究人員在熒光原位雜交技術和聚合酶鏈式反應技術的基礎上發展的幾種新技術，并分析了這些技術的應用現狀，對分子生物技術的發展做出了展望，希望能為污水處理系統穩定運行提供參考。

分子生物技術；硝化菌群；污水生物處理；熒光原位雜交

隨著分子生物技術的發展，污水生物處理系統也隨這發生了改進。污水生物脫氮是污水處理中最重要的環節，共包括兩個階段：硝化和反硝化。硝化階段主要利用硝化菌進行處理，如氨氧化菌（AOB）、亞硝酸鹽氧化菌（NOB）等。其中AOB可以將NH4+-N氧化成NO-2-N，NOB可以將NO-2-N氧化呈NO3-N。保證硝化細菌的存活和穩定繁殖是污水生物脫氮的關鍵所在。所以，利用分子生物技術對硝化細菌的活性、分布等進行研究，可有效促進污水脫氮系統的穩定與發展。目前，應用最多的分子生物技術是FISH技術（熒光標記的原位雜交）與PCR技術（聚合酶鏈式反應）。

1　基于FISH技術的分析方法

FISH技術是一種非放射性原位雜交技術。FISH的原理是檢測目標微生物RNA的特殊序列，制作出相對應的核酸探針，并將其與目標微生物進行原位雜交，然后利用CLSM（共聚焦激光掃描顯微鏡）對微生物進行分析。如圖1所示：

圖1　

FISH技術可以檢測污水中的絲狀菌、聚磷菌、硝化菌等，隨著研究的深入，人們對FISH技術進行了改進，研究出了如下幾種技術：顯微放射自顯影FISH技術（FISH-MAR）、微電極FISH技術（FISH-microelectrodes）以及Clone-FISH技術。

1.1顯微放射自顯影FISH技術

使用單一的FISH技術無法采集微生物的生理信息，使用單一的顯微放射自顯影技術則不能識別細菌的分布。而當這兩種技術被結合后，則能夠通過照片的方式將細菌的結構、分布等清晰地展現出來，并且能夠區分不同細菌的活性。

首先將需要分析的微生物進行培養，使其吸收底物中的放射性物質，通過放射自顯影可以清晰地看到吸收了放射性物質的細胞（MAR+，呈黑色）。培養底物分為有機底物和無機底物，有機底物通常用14C進行標記，如14C-乙酸等；而無機底物一般使用NaH14CO3。研究人員在對顯微放射自顯影FISH技術研究時，先將硝化生物膜在無機物底物中培養6h，硝化菌中有呈MAR+的硝化自養菌與呈MAR-的異養菌，之后將這些細菌放入只含的底物中培養10h，大部分異養菌都呈MAR+。這個實驗表明，異養菌可以通過14C來標記自養菌的代謝產物，使人們了解了在碳源不足時自養菌與異養菌的相互關系。研究結果表明，碳源不足時，自養菌與異養菌比例均為50%，這其中α-Proteobacteria占23%，γ-Proteobacteria占13%，Cytophaga Flavobacterium Bacteroides占2%，非硫細菌占9%，其他細菌占3%。

FISH-MAR雖然能夠直觀地對微生物結構、分布、代謝展開研究，但是對于細菌含量較低的物質卻不適用此方法。因此，如果硝化菌中沒有集中的菌落時，利用該方法將不能得到較好的檢測結果。

1.2微電極FISH技術

微電極FISH技術可以檢測污水生物生物膜內部的環境要素變化，進而檢測出微生物的活性。利用微電極FISH技術可以清晰地了解微生物分布、代謝、環境三者之間的關系。微電極FISH技術主要測量O2、H2S、NO3、NH4+以及PH等。

研究人員利用微電極FISH技術對自養硝化菌生物膜和污水生物生物膜中氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌的分布進行了研究。實驗結果表明，亞硝酸菌（nitrosomonas）優勢是氨氧化菌，而硝化螺旋菌（Nitrospira-like）優勢是亞硝酸鹽氧化菌，沒有硝化細菌（nitrobacter）。利用微電極FISH技術能較好地分析生物擴增（人工投入培養的硝化菌，增加硝化菌數量及活性）和生物刺激（投入培育底物達到對硝化菌生長的促進或抑制）對污水生物生物膜硝化的影響。曾經有專家想要通過增加培養底物中NH4+和NO2-來促進氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌的生長，但結果卻適得其反，NO2-的氧化效果不僅沒有增強，氨氧化菌的生長反而受到了抑制。

1.3Clone-FISH技術

用克隆的方法克隆出與檢測物有同種基因片段的Clones（克隆子），與FISH技術結合就成了Clones-FISH法，此方法可應用在如下兩個方面：①檢測核酸探針的有效性。②利用FISH技術檢驗克隆子中是否具有與檢測物相同的基因片段。

2　基于PCR技術的分析方法

在以往的檢測方法中，人們通常是從污水中提取硝化菌，但這種硝化菌的DNA含量很低，為檢測工作帶來了很大麻煩。而PCR技術能夠大量擴增DNA片段，從而解決了上述問題。

2.1amoA基因與16SrRNA基因

如果想要實現硝化菌DNA序列的擴增，首先應提取一段硝化菌帶有進化標記的DNA序列，找出該序列的保守區，制作出與之匹配的探針。氨氧化菌的帶有進化標記的基因一般是amoA基因與16SrRNA基因。

2.1.1amoA基因

amoA基因是編碼氨單加氧酶的一種基因，編碼氨單加氧酶是氨氧化菌獨有的胞內酶，共有三個基因，分別是amoA、amoB、amoC，而amoA中含有編碼氨單加氧酶的活性位點能夠將銨催化成羥胺，為氨氧化菌的成長供應能量。一個氨氧化菌中含有2～3個amoA，不同的amoA功能也不一樣。

2.1.216SrRNA基因

研究人員對16SrRNA基因的研究具有劃時代的意義，增加了人們對微生物生長的認識。16SrRNA基因有很強的保守性，根據微生物中16SrRNA基因的不同可以將微生物分為兩類，古細菌和細菌。許多書籍中對微生物的命名都是根據不同的16SrRNA基因分析的。一個氨氧化菌中只有一條16SrRNA基因，而不同的氨氧化菌的16SrRNA基因也不完全相同，從這些差異中可以看出不同氨氧化菌的關聯與進化差異。

有關專家對不同氨氧化菌中的amoA基因和16SrRNA基因的排列順序進行研究后發現，大部分氨氧化菌的amoA基因或16SrRNA基因的系統發育樹都比較相似，正是由于這一相似性，導致用16SrRNA基因制作的探針檢測的精確度受到影響。而amoA由于只在氨氧化菌中存在，盡管它對系統發育樹影響不大，但由于它的差異性使得利用amoA基因制作的探針精確性與特異性比16SrRNA基因要強，能準確地辨別氨氧化菌的種屬。目前，這兩種探針都只能在自養型氨氧化菌中使用，而無法對實際污水中種群的多樣性進行分析。

2.2PCR-變性梯度凝膠電泳克隆測序技術

PCR-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）技術是將利用PCR技術擴增的DNA片段植入到凝膠中進行電泳的一種技術。凝膠一般是聚丙烯酰胺凝膠，且加入了梯度變性劑，一般是尿素和甲酰胺。利用PCR技術擴增的DNA片段長度是可控的，可以保證長度的一致性，但是DNA內部的堿基排列卻有所不同。在進行電泳時，不同的堿基排列會根據梯度變性劑濃度的變化而發生變性，電泳速度越來越慢，最終各自停留在相應的位置，之后在對其進行染色，凝膠上就會出現若干條DNA譜帶，一條譜帶就是一個DNA片段。而這種方法經常會受到單鏈DNA、探針特異性等的影響，導致檢測結果不準確。為了避免這一影響因素，研究專家經常會在測驗后再進行Cloning（克隆）和Sequencing（測序），以對檢測結果進行進一步確認，即所謂的PCR-DGGE-cloning-sequencing（PCR-變性梯度凝膠電泳克隆測序技術）。

研究人員利用此技術對污水處理系統內硝化菌群進行了研究，發現在污水處理過程中，氨氧化菌的數量是不會改變的。但是若受到外界因素（如溫度、水質）的影響，氨氧化菌的種群結構會發生較大的改變。研究人員在研究曝氣對污水中硝化細菌的結構與脫氮效率造成的影響時注意到，供氧時間的長短對污水中硝化菌的種群結構會產生一定的影響。經過研究，脫氮效率與氨氧化菌的含量以及種群多樣性并無關系。

利用PCR-變性梯度凝膠電泳克隆測序技術能夠清晰的展示污水處理中硝化菌的種群結構和數量的變化。然而，凝膠中DNA片段的堿基對一般不超過500，這一片段的序列又要與檢測序列的重合度大于85%，否則就不能對硝化菌進行準確的分類，無法收集有關硝化菌的數據。另外，此技術的靈敏度不高，凝膠配置濃度不容易掌握，導致此技術對微生物含量少的種群沒有理想的檢測能力。

3　結論與展望

3.1分子生物技術從細微層面研究了影響污水處理系統中硝化菌生長的條件，文中所提到的脫氮技術應得到大力發展，例如：硝化、反硝化、短程脫氮、氨氧化等。脫氮技術能夠對不同微生物種群的代謝加以識別，反映出微生物種群變化與污水處理系統設置參數的關系，從而更快速、更精準的做出一些改變，對污水處理系統能夠穩定運行有深刻的影響及指導作用。

3.2在未來的發展中，應完善分子生物技術研究時的具體操作流程，積極引進新技術、新方法，提高檢測的準確性以及特異性，如FISH-MAR、Clone-FISH、同位素探測等方法的操作流程應進一步完善，加強對核酸探針和引物的改進，使其能更精確地反映出微生物種群活性與外界環境的關系。相信在未來的污水處理中，分子生物技術會隨著科技的進步，研究方法更方便快捷，在對污水處理系統的檢測中更為穩定、精確，還可以為運行研發實時監測生物反應器提供技術引導。

［1］李磊，曾薇，張悅，楊瑩瑩.分子生物技術在污水處理系統內硝化菌群研究中的應用［J］.應用與環境生物學報，2010（1）：135-142.

［2］朱文優，張忠剛.分子生物學技術在環境微生物研究中的應用［J］.宜賓學院學報，2009（6）：88-90.

［3］王曉丹，李艷紅.分子生物學方法在水體微生物生態研究中的應用［J］.微生物學通報，2012（4）：777-781.

［4］臧藝鵬，李悅，曲洋，等.固定化微生物技術——載體截留法在污水生物處理中的研究應用［J］.科技信息，2010（7）：355-356.

Application of Molecular Biological Technology in the Study of the Nitrification Bacteria in Wastewater Treatment System

Yang Hao1Diao Zhimin1Liang Hongxing2
（1.School of Life and Geographical Sciences，Qinghai Normal University，Xining Qinghai 810008；2.Chongqing Hechuan Quruishan Middle School，Hechuan Chongqing 401520）

Molecular biological technology has been rapid developedin recent years，widely used in the studyof en?vironmental microbiology，this paper introduces severalnew technologies developedin recent years by researchers based on fluorescence in situ hybridizationtechnology and polymerase chain reaction technology in detail，and ana?lyzes the running state ofthese technologies，makes a prospect for the development of molecular biological technol?ogy，hoping toprovide reference for the stable operation of sewage treatment system.

Molecular biologicaltechnology；Nitrification bacteria；Wastewater biological treatment；Fluorescencein situ hybridization

X703

A

1003-5168（2015）05-0125-3

2015-4-23

楊浩（1993.9-），男，本科在讀，研究方向：生物科學。