副豬嗜血桿菌分離株的分離鑒定及藥敏試驗

董永軍，王麗榮，徐銀蘭，賀會利，趙俊江，孟偉杰

（1.河南科技學院動物科學學院，河南新鄉453003；2.河南科技學院抗體工程重點實驗室）

副豬嗜血桿菌分離株的分離鑒定及藥敏試驗

董永軍1，2，王麗榮1，2，徐銀蘭1，賀會利1，趙俊江1，孟偉杰1

（1.河南科技學院動物科學學院，河南新鄉453003；2.河南科技學院抗體工程重點實驗室）

副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌（Hps）引起的一種細菌性傳染病.從疑似發生副豬嗜血桿菌病的河南新鄉某豬場采集病豬呼吸道分泌物和心包積液，并對樣品進行細菌分離培養、形態觀察、培養特性、生化試驗鑒定和動物試驗。結果表明，該試驗成功分離到了副豬嗜血桿菌，藥敏試驗顯示，分離菌株對慶大霉素、環丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星和頭抱哌酮高敏，對復方新諾明中敏，對青霉素、鏈霉素、林可霉素耐藥；對金銀花及其組成的復方敏感，且復方作用效果優于單方。

副豬嗜血桿菌；分離鑒定；藥敏試驗；豬

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，Hps）是存在于豬上呼吸道的一種常在菌，在特定條件下可以侵入機體引起以呼吸道癥狀為主的全身性疾病，即副豬嗜血桿菌病，又稱革拉瑟氏病［1-2］。

副豬嗜血桿菌屬革蘭氏染色陰性的細小桿菌，具有多種不同的形態，顯微鏡下可見呈球桿狀、長桿狀與長絲狀菌體，無鞭毛、無芽抱，有莢膜，兼性厭氧［3-5］。

目前，副豬嗜血桿菌病已嚴重危害到養豬業的健康發展，分離鑒定副豬嗜血桿菌并進行藥敏試驗意義重大，對該病的預防、控制有著非常重要的作用［6-8］。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料 從疑似發生副豬嗜血桿菌病的河南省新鄉市某豬場采集發病豬的呼吸道分泌物、心包積液。

1.1.2 試劑 葡萄糖、半乳糖、蔗糖、脈酶等生化微量鑒定管；營養瓊脂，煙酰胺腺嘌吟二核苷酸（NAD或V因子），金黃色葡萄球菌；生化試驗試劑：脈酶、氧化酶、接觸酶、吲哚、葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖和核糖等。

1.1.3 培養基 兔鮮血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板、普通營養瓊脂平板、TSB培養基在實驗室按常規

方法制備。

1.1.4 中藥 板藍根、大青葉、金銀花、貫眾、魚腥草、野菊花、黃答、連翹。復方①黃答、金銀花、連翹。復方②大青葉、魚腥草、貫眾。

1.1.5 西藥 環丙沙星、氧氟沙星、頭抱哌酮、復方新諾明、林可霉素、諾氟沙星、青霉素、鏈霉素及慶大霉素藥敏片（河南科技學院藥理實驗室制備）。

1.2 病原菌分離及鑒定

1.2.1 病原菌分離 無菌條件下，用接種環挑取疑似患豬呼吸道分泌物或心包積液，劃線接種于巧克力瓊脂平板和普通營養瓊脂平板，置5%CO2培養箱中，37℃恒溫培養48 h后，取出培養基，挑取疑似副豬嗜血桿菌單個菌落，進行純培養。

1.2.2 涂片鏡檢 挑取上述純培養疑似副豬嗜血桿菌單個菌落，分別涂片、革蘭氏染色后，顯微鏡下觀察菌體形態及染色結果。

1.2.3 衛星現象檢查 無菌條件下，挑取副豬嗜血桿菌疑似菌落，水平劃線于未添加NAD的兔鮮血瓊脂平板，再挑取金黃色葡萄球菌垂直水平劃線接種于平板，置5%CO2培養箱中37℃恒溫培養24～48 h后，觀察細菌生長情況，是否有衛星生長現象及溶血現象。

1.2.4 生化試驗 挑取具有衛星生長現象且不溶血的單個菌落純培養后接種于添加NAD的含葡萄糖、半乳糖、蔗糖、脈酶等生化微量鑒定管中，置5% CO2培養箱中37℃恒溫培養24～48 h后，觀察生化反應和糖發酵活性結果，同時進行氧化酶試驗和接觸酶試驗，觀察結果。

1.2.5 動物試驗 將疑似副豬嗜血桿菌的平板上菌落用滅菌生理鹽水洗下，經二次離心沉淀洗滌后懸浮于3 ml生理鹽水中，各取0.4 m L靜脈接種于3頭哺乳仔豬體內，觀察其表現，死后解剖采集呼吸道分泌物，進行二次分離鑒定。

1.3 藥敏試驗

1.3.1 中藥 按傳統水煎法煎煮，真空抽濾及濃縮，最后濃縮為1 g/mL生藥，置-20℃保存。濾紙打孔直徑為6 mm，121℃高壓滅菌，將紙片放入藥液中浸泡2 h，置37℃烘干，于-20℃保存備用。將確診的副豬嗜血桿菌菌落接種于TSB培養基中，在超凈臺中利用滅菌棉簽從TSB中蘸取少量均勻涂布于添加有NAD的兔鮮血瓊脂平板上，稍干后，用無菌鑷子將各種藥敏紙片分別貼于平板上，37℃培養24 h后，觀察測定抑菌圈直徑。

1.3.2 西藥 將確診的副豬嗜血桿菌菌落接種于TSB培養基，在超凈臺中利用滅菌棉簽從TSB中蘸取少量均勻涂布于添加有NAD的兔鮮血瓊脂平板上，稍干后，用無菌鑷子將藥敏紙片分別貼于平板上，37℃培養24 h后，觀察測定抑菌圈直徑。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離結果 將呼吸道分泌物或心包積液分別接種于巧克力瓊脂平板和普通營養瓊脂平板，37℃培養48 h后，通過實驗觀察結果如下。

普通營養瓊脂平板上無菌落生長；巧克力瓊脂平板上生長有邊緣整齊、小而透明菌落。

2.2 涂片鏡檢結果 采集疑似副豬嗜血桿菌單個菌落抹片、革蘭氏染色后顯微鏡觀察，可見大小不等，短小桿狀、球桿狀、絲狀等多種不同形態細菌，革蘭氏染色陰性。

通過細菌分離培養與形態、革蘭氏染色觀察，初步判定該細菌為副豬嗜血桿菌，確診需進一步進行生化試驗。

2.3 衛星現象檢查結果 通過實驗觀察：在金黃色葡萄球菌周圍可見生長有針尖大小、圓形、邊緣整齊的菌落，離金黃色葡萄球菌愈近菌落生長越好，愈遠菌落越小，呈現出明顯的“衛星現象”，同時未見溶血現象；未接種金黃色葡萄球菌的另一平板則未見菌落生長。

2.4 生化試驗結果 詳見表1。

表1 生化試驗結果

根據細菌形態、革蘭氏陰性、衛星生長現象、不溶血現象，結合生化試驗結果可以確診，分離細菌符合副豬嗜血桿菌的生物學特性。

2.5 動物試驗結果 經靜脈接種的3頭供試哺乳仔豬均出現精神沉郁，食欲減退，體溫升高至40.5℃～42℃，咳嗽，呼吸困難，皮膚發紅，皮膚黏膜發紺，腕關節和跗關節腫脹、跛行、站立困難，疼痛。死前共濟失調、抽搐、四肢呈劃水狀。

病理剖檢可見心包積液，呼吸道內有大量分泌物。采集分泌物按上述方法進行第二次細菌分離鑒定，結果一致，確診該細菌為副豬嗜血桿菌。

2.6 藥敏試驗結果

2.6.1 中藥 37℃培養24 h后，測定藥敏紙片抑菌圈大小，結果詳見表2。

單味中藥金銀花、魚腥草、野菊花、板藍根抑菌作用良好，尤以金銀花效果較優；2種復方均有抑菌作用，尤以復方1最優。藥敏試驗結果表明，金銀花及其復方對副豬嗜血桿菌的抑菌作用明顯。黃答、連翹對副豬嗜血桿菌無明顯抑菌作用，但與金銀花組方效果優于單方金銀花，可能與組方各種中藥相須協同作用有關。

表2 中藥藥敏試驗結果

2.6.2 西藥 結果詳見表3。

結果顯示，慶大霉素、環丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星和頭抱哌酮高敏；復方新諾明中敏，青霉素、鏈霉素、林可霉素耐藥。

表3 副豬嗜血桿菌西藥藥敏試驗結果

Hps血清型較多，目前報道有15種，不同菌株對同一種抗生素的敏感性存在很大差異，臨床治療應結合分離菌株的藥敏試驗結果，科學用藥。

3 小結與討論

本試驗通過對疑似發病豬場采集患豬病料，并進行病原菌分離鑒定、動物試驗，鑒定為副豬嗜血桿菌。

通過藥敏試驗，確診分離菌對慶大霉素、環丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星和頭抱哌酮高敏，復方新諾明中敏，青霉素、鏈霉素、林可霉素耐藥；對金銀花及其組成的復方敏感，且復方作用效果優于單方［9］。

副豬嗜血桿菌病臨床治療上中藥建議使用金銀花及其組成復方，西藥建議使用慶大霉素、環丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星和頭抱哌酮。

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S858.28

A

1005-7307（2015）01-0001-003

2014-12-05

新鄉市重點科技攻關項目（ZG13009）；河南科技學院大學生創新訓練計劃項目（2013CX046）

董永軍，男，碩士，講師，主要從事基礎獸醫學的教學科研工作。