高效液相色譜法測定奧硝唑分散片含量

天津醫(yī)科大學代謝病醫(yī)院（300070）周瑾

天津醫(yī)科大學（300070）劉照勝

奧硝唑分散片用于治療由厭氧菌（脆弱擬桿菌、狄氏擬桿菌、卵園擬桿菌、多形擬桿菌、普通擬桿菌、梭狀芽胞桿菌、真桿菌、消化球菌和消化鏈球菌、幽門螺桿菌、黑色素擬桿菌、梭桿菌、CO2噬織維菌、牙齦類桿菌等）感染引起的多種疾病；男女泌尿生殖道毛滴蟲、賈第氏鞭毛蟲感染引起的疾病（如陰道滴蟲病等）；腸、肝阿米巴蟲病（包括阿米巴痢疾、阿米巴肝膿腫），腸、肝變形蟲感染引起的疾病；用于預防和治療各科手術后厭氧菌感染。本文以替硝唑為內標，采用反相HPLC法測定奧硝唑的含量，用于奧硝唑分散片的質量控制。結果表明，本法簡便準確，適用于奧硝唑制劑的常規(guī)質量控制。

1 儀器與試藥

島津LC一10AT 型HPLC 儀，包括SPD一10A 型紫外檢測器、LC—R6A 型數據處理機和7725型定量進樣器。奧硝唑對照品(自制，含量99.4%)、甲硝唑對照品(中國藥品生物制品檢定所，含量99.8%，批號07254)；乙腈（色譜純）；KH2PO4（分析純，批號070221，天津化學試劑二廠）；鹽酸（分析純，批號071003，天津化學試劑二廠），實驗用水為雙蒸餾水；奧硝唑分散片（0.2 5 g/片，國藥準字H20040375，批號：20130518，20130608，20130825，河南天方藥業(yè)有限公司）。

2 試驗方法與結果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱為Shimpack CLC—ODS柱(4.6 mm×150 mm,5u)；流動相乙腈-KH2PO4(0.01 mol·L-1)(22∶78，v/v)，使用前超聲脫氣20min，0.45μm微孔濾膜抽濾；流速1.0ml／min；檢測波長310nm；進樣量10μl；柱溫為室溫。在上述色譜條件下，模擬處方中，奧硝唑的出峰時間為5.8min，替硝唑出峰時間為2.7min；按奧硝唑峰計算理論板數不低于1000，奧硝唑與甲硝唑的色譜峰分離度大于1.5。色譜圖見附圖1。

2.2 溶液制備

附圖1 模擬處方中奧硝唑與甲硝唑色譜圖

附圖2 模擬空白處方

附表1 回收率測定結果（n＝9）

附表2 精密度試驗結果（n＝9）

附表3 三批奧硝唑分散片的含量測定結果

2.2.1 對照品溶液的制備 分別取經五氧化二磷減壓干燥至恒重的奧硝唑對照品與甲硝唑對照品各約25mg，精密稱定，分別置50ml量瓶中，加流動相適量，超聲10min使溶解，放冷，加流動相至刻度，搖勻，分別得到奧硝唑對照儲備液及甲硝唑（內標）液。精密量取1.0 ml奧硝唑對照儲備液，置25ml量瓶中，再精密加入內標液1.0ml，加流動相稀釋至刻度，搖勻，得到對照品溶液 (奧硝唑濃度為20μg/ml，內標物濃度為20μg/ml)。

2.2.2 供試液的配制 取供試品10片，精密稱定，求出平均裝量。將膠囊的內容物混合均勻，研細，精密稱取適量，（約相當于奧硝唑25mg），置于50ml量瓶中，加流動相適量，超聲處理5min，使奧硝唑溶解，用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液1ml，置另25ml量瓶中，精密加入內標液1.0 ml，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液（約相當于奧硝唑20μg/ml）。

2.3 結果

2.3.1 空白對照 按處方工藝制備不含奧硝唑的模擬制劑，按供試液配制方法，制備不含內標物的空白對照，10μl進樣，得到附圖2，說明處方中敷料不影響奧硝唑的測定。

2.3.2 線性范圍 精密量取不同體積奧硝唑對照液儲備液，分別置25ml量瓶中，精密加入1.0ml內標液，用流動相稀釋至刻度，搖勻，分別配成濃度為4、8、16、24、32及40μg/ml的對照液，分別進樣10μl，記錄不同濃度的色譜峰面積，以濃度C對奧硝唑對替硝唑的峰面積比（A1/A2）做最小二乘法線性回歸分析，得到回歸曲線為A1/A2＝4.220C+0.054（r＝0.9998，n＝5）。結果顯示，峰面積比與奧硝唑濃度之間的線性關系良好。

2.3.3 準確度實驗

2.3.3.1 校正因子f的測定 精密量取不同體積的對照液儲備液，分別置25ml量瓶中，分別精密加入1.0ml內標液，以流動相稀釋至刻度，得到濃度分別為16μg/ml、20μg/ml及24μg/ml的三種溶液。每個濃度分別進樣3次，每次10μl，按公式f＝（A內標/C內標）/（A對照/C對照）計算f值，f的平均值為0.931。

2.3.3.2 回收率的測定

取三份模擬的空白處方，分別置50ml量瓶，分別精密加入不同量的苯酰甲硝唑對照品，加流動相適量，超聲處理5min，用流動相稀釋至刻度，搖勻。濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液1.0ml，置另一25ml量瓶中，精密加入一定量的內標液，用流動相稀釋至刻度，搖勻。10μl進樣，每個濃度重復測定3次，測得奧硝唑與內標物的峰面積，計算奧硝唑回收率，結果見附表1。

2.3.4 精密度試驗

2.3.4.1 重復性試驗 在同一時間內，由一名實驗人員分別配制不同含量的苯酰甲硝唑的模擬處方，按“2.2.2供試液配制”規(guī)定方法配制待測樣品，使奧硝唑的濃度分別為16、20、24μg/ml，進樣10μl，每個濃度重復3次，測定奧硝唑及內標物的峰面積，計算9次測定的f值的RSD，結果見附表2。結果表明，本方法重復性良好。

2.3.4.2 中間精密度試驗 在不同日期內，由不同分析人員分別配制不同含量的奧硝唑的模擬處方，按“2.3供試液配制”規(guī)定方法配制待測樣品，使奧硝唑的濃度分別為16、20、24μg/ml，進樣10μl，每個濃度重復3次，測定奧硝唑及內標物的峰面積，計算9次測定的f值的RSD，結果見附表2。結果表明，本方法中間精密度較好。

2.3.4.3 供試液穩(wěn)定性試驗 取2.2.2項下的供試品溶液，自然放置，分別于0、2、6、12小時進樣10ul，測定奧硝唑與甲硝唑的面積比（A1/A2）， 考察供試液的穩(wěn)定性，結果表明，12小時內的A1/A2RSD為1.07%，供試液在12小時內穩(wěn)定。

2.3.5 樣品測定 取不同批號的奧硝唑分散片，分別按“2.2.2項下”規(guī)定處理，測定每批奧硝唑相對標示量的百分含量，結果見附表3。

3 討論

根據文獻報道[1][2][3][4]，奧硝唑的測定一般采用甲醇一水或甲醇一磷酸緩沖鹽作流動相，以甲硝唑為內標測定奧硝唑的含量。通過試驗比較，我們發(fā)現甲醇一水或甲醇一磷酸緩沖鹽體系效果均不理想，供試液不穩(wěn)定。改用乙腈-KH2PO4(0.01 mol·L-1)(22∶78，v/v)后，色譜峰分離理想，色譜系統(tǒng)適用性指標均令人滿意。

反相高效液相色譜技術具有靈敏、簡便、分離效能高等優(yōu)點，目前已經廣泛應用。應用此技術對分析奧硝唑分散片的含量有很大意義，本文方法準確度高，精密度及樣品穩(wěn)定性均較好，可作為實踐中常規(guī)應用的一種簡便、可靠、快速的分析方法。