高危型HPV載量 HIF-1α在CIN的表達及與LEEP術(shù)后患者的相關(guān)性分析

陳艷　林琳　賈志強

高危型HPV載量 HIF-1α在CIN的表達及與LEEP術(shù)后患者的相關(guān)性分析

陳艷林琳賈志強

目的 探討高危型人乳頭狀瘤病毒（HPV）載量及缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）在宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變（CIN）的表達及發(fā)病過程中的相關(guān)性。方法 行環(huán)狀電圈切除術(shù)（LEEP）患者，CIN Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ級各50例，并選取同期體檢健康女性50例為對照組，采用免疫組織化學(xué)方法檢測HIF-1α的表達，采用HPV-DNA雜交捕獲Ⅱ（HC-Ⅱ）方法檢測高危型HPV-DNA，并用ROC曲線分析高危型HPV-DNA判斷宮頸病變理想的RLU/CO界值。結(jié)果 高危型HPV RLU/CO值及多個性伴侶因素組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，HIF-1α在 CINI、II、III級中表達率分別為 26%、54 %、68%，呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，HIF-1α的陽性表達率與CIN分級成正相關(guān)（R=0.377，P=0.000），與HPV RLU/CO值成正相關(guān)（R=0.309，P=0.000）。Logistic回歸分析，HPV載量、多個性伴侶、HIF-1α表達均為危險因素。ROC曲線分析，確定預(yù)測CINII、CINIII宮頸病變最佳RLU/CO值3.805，靈敏度81%，特異度79%，Youden指數(shù)=0.600。結(jié)論 高危型HPV載量及HIF-1α與CIN存在明顯相關(guān)性，兩者聯(lián)合檢測可以更準確地判斷CIN病變程度及生物學(xué)行為，預(yù)測CIN病變最佳HPV載量為3.805。

宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變 缺氧誘導(dǎo)因子-1α 乳頭狀瘤病毒 病毒負荷量 雜交捕獲

宮頸癌是我國婦科惡性疾病死亡的主要原因之一，高危型人乳頭狀瘤病毒（HPV）感染是宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）發(fā)生的必要條件，CINⅡ、Ⅲ患者術(shù)后高危型HPV載量與宮頸病變相關(guān)，近年來成為國內(nèi)CIN患者經(jīng)環(huán)狀電圈切除術(shù)（LEEP）后的隨訪內(nèi)容。缺氧誘導(dǎo)因子1 （HIF-1）是維持機體氧平衡的核心轉(zhuǎn)錄基因，是近年來腫瘤研究的熱點。本文探討高危型HPV載量判斷宮頸病變CINⅡ、Ⅲ級理想的RLU/CO界值，進一步分析HIF-1α參與CIN的可能機制及作用。

1　臨床資料

1.1一般資料 2009年6月至2013年1月本院行LEEP患者150例，選擇同期體檢健康女性50例為對照組，所有入選者年齡20～56歲，平均（39.97±9.67）歲。LEEP術(shù)患者均由同一位經(jīng)驗豐富的醫(yī)師操作，以病理檢查結(jié)果為最終診斷，所有病理切片均由資深病理學(xué)專家復(fù)核。按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）診斷標準進行臨床分期： Ⅰ級，Ⅱ級，Ⅲ級各收集50例。入選標準：既往無冠心病、腦血管病家族史、糖尿病、肝、腎、血液、自身免疫性疾病及妊娠者。本項目通過本院倫理委員會批準，所有標本的收集均經(jīng)受試者本人或家屬同意。排除標準：腦卒中、嚴重心臟疾病近期發(fā)生心肌梗死或心絞痛疾病、嚴重感染、嚴重肝、腎功能不全、血栓性疾病、腫瘤、曾行放化療或生物學(xué)治療患者。

1.2高危型HPV-DNA檢測 高危型HPV-DNA檢測采用美國Digene公司HPV-DNA雜交捕獲Ⅱ（HC-Ⅱ）的方法，HC-Ⅱ試劑盒購自美國Digene公司。共檢測13個高危HPV基因型，包括HPVl6、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68。操作嚴格按照試劑盒說明。

1.3HIF-1α表達的檢測 HIF-1α表達的檢測采用兔抗人HIF-1α單克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司），染色方法嚴格按照說明進行，顯微鏡下觀察并計數(shù)陽性染色細胞數(shù)。HIF-1α主要表達于細胞核與細胞質(zhì)，以棕褐色或棕黃色顆粒者為陽性，參考Swinson等［1］的判斷標準，根據(jù)腫瘤細胞顯色的比例及染色強度，對HIF-1α表達作半定量評定。參考肖帥等［2］研究，陽性細胞率評分：0分：陽性細胞數(shù)＜1%。1分：1%～10%。2分：11%～50%。3分＞50%。按顯色程度評分：1分：染色弱。2分：中等染色。3分：強染色。兩種評分結(jié)合起來分為4級：無論染色強度如何，細胞陽性率＜10%為陰性。2～3分為陽性（+）。4～5分為中度陽性（++）。6～7分為強陽性（+++）。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件分析。計數(shù)資料行χ2檢驗，等級資料行秩和檢驗，計量資料以（x±s）表示，用單因素方差分析。采用非條件多項式Logistic回歸分析病毒載量、HIF-1α表達及其他多因素與各級CIN的關(guān)系。確定閾值采用ROC曲線，真陽性率與假陽性率之差為Youden指數(shù)，取最大Youden指數(shù)為HPV-DNA負荷的最佳閾值。

2　結(jié)果

2.1CIN高危因素的單因素分析 見表1。

表1　CIN高位因素的單因素分析［n，（x±s）］

2.2HIF-lα在宮頸上皮內(nèi)瘤樣變中的表達 HIF-1α的陽性表達率與CIN分級成正相關(guān)（R=0.377，P=0.000），與HPV RLU/CO值成正相關(guān)（R=0.309 P=0.000）見表2。

表2　HIF-1α在宮頸上皮內(nèi)瘤變中的表達（n）

2.3Logistic 回歸分析 采用二分類非條件Logistic回歸分析HPV載量及HIF-1α表達與CIN高危因素的關(guān)系，將單因素分析篩選出的可能危險因素進一步進行多因素Logistic回歸分析，最終進入模型的因 素：HPV載 量（OR=4.206，95% CI為1.826～9.691；P=0.001），多個性伴侶（OR=4.406，95% CI為1.942～9.997；P=0.000），HIF-1α表達（OR=2.457，95% CI為1.364～4.424；P=0.003）均為危險因素，見表3。

表3　HPV載量及HIF-1α表達與CIN高危因素的關(guān)系的logistic回歸分析

2.4高危型HPV病毒載量預(yù)測宮頸病變閾值的確定 根據(jù)病理組織學(xué)結(jié)果，以健康體檢人群及CIN I為陰性，CINII、III為陽性，高危HPV-DNA病毒載量預(yù)測CIN II、III宮頸病變閾值的ROC曲線，結(jié)果提示預(yù)測CINII、III宮頸病變，高危型HPV病毒載體最佳RLU/CO閾值為3.805，靈敏度81%、特異度79%，Youden指數(shù)=0.600。

3　討論

HPV病毒感染后，僅少數(shù)患者HPV載量一直持續(xù)在較高的水平，并逐漸由量變發(fā)生了質(zhì)變，感染細胞異常增生，直至出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變，導(dǎo)致宮頸癌。HPV感染是CIN發(fā)生、發(fā)展的必要條件，但并不是充分條件。有研究報道子宮頸暴露HPV病毒的載量和型別對于宮頸高度病變及子宮頸癌發(fā)生的致病風(fēng)險至關(guān)重要［3］。本資料顯示，宮頸病變中HPV感染率與HPV病毒負荷量均隨著宮頸病變級別升高，隨著HPV病毒負荷量的增高，宮頸病變程度越高；宮頸病變級別越髙。目前，CIN治療方法主要為LEEP術(shù)［4］，LEEP術(shù)陽性切緣的患者25%～50%可能病灶殘留或復(fù)發(fā)。

本資料應(yīng)用雜交捕獲HPV-DNA檢測技術(shù)HC-Ⅱ法測定；有研究報道［5］HC-Ⅱ檢測法在CIN II級以上，其宮頸病變敏感性＞90%，但其特異性偏低，門診宮頸癌篩查其診斷意義不明確，不典型鱗狀細胞分層特異性＜50%。而本資料結(jié)果提示，預(yù)測CINII級以上高危HPV-DNA病毒載量最佳值為3.805，靈敏度81%、特異度79%，Youden指數(shù)=0.600，分析其原因可能有：（1） HPV感染患者可通過體內(nèi)免疫系統(tǒng)可自然消退。（2）HC-Ⅱ檢測方法與其他低危型HPV基因有交叉反應(yīng)，尤其是RLU/CO值＜2時其敏感性及特異性均受影響。故作者認為提高HPV-DNA陽性閾值至3.805可提高HC-II法檢測的特異性，可降低其檢測CIN II、Ⅲ級宮頸病變的假陽性率，而對其敏感性僅輕微影響。

近年來關(guān)于腫瘤發(fā)生、發(fā)展的影響因素的研究中，腫瘤細胞內(nèi)部缺氧作為一個新的觀點逐步引起重視。其發(fā)生機制可能為當腫瘤細胞缺氧時，通過對HIF-1α調(diào)節(jié)，從而影響細胞能量代謝、血管發(fā)生及舒縮的控制，繼而介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子、紅細胞生成素、糖酵解酶等多個基因的轉(zhuǎn)錄［6］，誘導(dǎo)新生血管生成，使腫瘤細胞適應(yīng)缺氧微環(huán)境。HIF-1α在 CINI、II、III 中陽性表達呈逐漸上升趨勢。在組織學(xué)分級，HIF-1α的陽性表達率與CIN分級成正相關(guān)（R=0.377），與HPV RLU/CO值成正相關(guān)（R=0.309），因此作者認為，臨床上對HIF-1α蛋白的檢測將有助于子宮內(nèi)膜改變的診斷及鑒別診斷，且與HPV病毒載量成弱正相關(guān)關(guān)系，能夠預(yù)測腫瘤的發(fā)展趨勢和轉(zhuǎn)移潛能，有望成為一種新的臨床診斷指標。

1Swinson DE，Jones JL，Cox G，et al. Hypoxia-inducible factor-1 alpha in non small cell lung cancer， relation to growth factor， protease and apoptosis pathways. Int JCancer，2004，l 11（1）：43.

2肖帥，盧先州，劉龍飛，等. 缺氧誘導(dǎo)因子-1α及轉(zhuǎn)錄因子Snail與直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系. 中華實驗外科雜志，2012，29（2）：212-213.

3Gravitt PE， Kovacic MB， Herrero R， et al. High load for most high risk human papillomavirus genotypes is associated with prevalent cervical cancer precursors but only HPV16 load predicts the development of incident disease. Int J Cancer.2007， 121（12）：2787～2793.

4余進進，舒珊，王元，等. 腹腔鏡輔助陰式根治性子宮切除術(shù)治療宮頸癌的臨床研究.中國醫(yī)師雜志，2011， 13（6）：329～330

5Ordi J1， Puig-Tintoré LM， Torné A， et al. Contribution of high risk human papillomavirus testing to the management of premalignant and malignant lesions of the uterine cervix Med Clin ， 2003，121（12）：441～445.

6Kelly B D，Hackett S F，Hirota K，et al . Cell type-specific reguiation of angiogenic growth factor gene expression and induction of angiogenesis in nonischemic tissue by a constitutiveiy active form of hypoxiainducibie factor1. Circ Res，2003，93（11）：1074～1081.

浙江省瑞安市科技計劃項目（201102060）

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