Survivin抑制劑YM155聯合阿糖胞苷對人白血病K562細胞系的作用及機制

封蔚瑩　金晶　洪攀

Survivin抑制劑YM155聯合阿糖胞苷對人白血病K562細胞系的作用及機制

封蔚瑩金晶洪攀

目的 探討survivin抑制劑YM155聯合阿糖胞苷（Ara-C）對人白血病K562細胞系的增殖抑制和誘導凋亡作用及機制。方法 實驗設6組：對照組、YM155單藥組、Ara-C單藥組、YM155和Ara-C聯合組、YM155序貫Ara-C組、Ara-C序貫YM155組，分別作用于K562細胞。以CCK法檢測增殖抑制率，流式細胞儀檢測細胞凋亡，western blot法檢測凋亡相關蛋白表達。結果 CCK-8法顯示YM155和Ara-C單藥均能抑制K562細胞生長，YM155序貫Ara-C組細胞增殖抑制率和凋亡率高于其他給藥方式組。YM155序貫Ara-C組survivin、Mcl-1蛋白表達顯著下降。結論 YM155序貫Ara-C聯合能顯著抑制K562細胞增殖，可能通過下調survivin、 Mcl-1蛋白誘導K562細胞凋亡。

survivin YM155 阿糖胞苷 K562細胞

慢性粒細胞白血病（CML）是一種惡性血液病，CML加速急變期后使用常規聯合化療效果不理想。近來國內外開展了Ara-C等藥物聯合作用于CML急變期細胞的體外研究，均顯示有一定療效［1，2］。作者自2012年6月至2014年6月通過實驗研究，探討新型小分子survivin抑制劑YM155聯合Ara-C對CML細胞系K562的協同效應和可能機制。

1　材料和方法

1.1藥物、試劑 YM155（美國Selleck Chemicals公司），Ara-C（美國法瑪西亞公司），RPMI1640培養液及胎牛血清（美國Sigma公司），AnnexinV PI試劑盒（碧云天生物技術研究所），CCK-8試劑盒（上海前塵生物科技有限公司），Survivin 和Mcl-1兔抗人多克隆抗體（美國Cell Signaling公司），HRP標記羊抗兔IgG（英國GE公司），兔抗人B-actin多克隆抗體及HRP標記羊抗鼠IgG（美國Sigma公司）。

1.2細胞系及培養 CML急變期K562細胞系（中國科學院上海細胞生物學研究所），于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，在37℃、5%CO2、飽和濕度孵育箱內培養，2～3 d傳代1次，臺盼藍拒染法測定細胞活力，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3細胞增殖抑制實驗 分別以YM155（0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0nmol/L）和Ara-C（2，4，8，16，32，64μg/ml）單藥治療K562細胞48 h和72h，采用CCK-8活性檢測試劑盒，操作按照說明書，以酶標儀檢測A450處吸光度，以A450（作用組-空白組）/（正常組-空白組）×100%的值為細胞存活率，1-細胞存活率為增殖抑制率。Calcusyn藥效學軟件計算藥物IC50值。

1.4聯合和序貫用藥的增殖抑制實驗 按照前述實驗得出的藥物IC50值選擇YM155（1.0nmol/L）與Ara-C（4.0μg/ml），實驗設6組：空白對照組、YM155單藥組（Y組）、Ara-C單藥組（A組）、YM155和Ara-C聯合組（Y+A組）、YM155預處理12h序貫Ara-C組（Y→A組）、Ara-C預處理12h序貫YM155組（A→Y組），分別作用于K562細胞48h。以CCK-8法檢測增殖抑制率，得出最佳結果。

1.5流式細胞儀凋亡檢測 仍以上述6組作用于K562細胞，操作按照Annexin FITC-PI試劑盒說明書，以流式細胞儀檢測細胞凋亡率，Annexin 陽性為早期+晚期凋亡細胞［3，4］，比較各組細胞凋亡情況。

1.6Western blotting 檢測凋亡相關蛋白 設4組：對照組、YM155組、Ara-C組、最佳聯合作用組。作用于K562細胞0h、12h、24h、36h，收集細胞并裂解提取蛋白于-80℃保存，按照既往方法電泳、轉膜、一抗及二抗孵育并ECL顯影，掃描成像并進行灰度值差異分析［5］。

1.7統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計量資料用（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1YM155與Ara-C單藥對K562細胞增殖的影響 CCK-8法檢測結果顯示，YM155單藥對K562細胞48h、72h的IC50值分別為3.5nmol/L和1.2mmol/L，上述濃度Ara-C單藥在48h未達半數抑制濃度，其72h的IC50值為 3.5μg/ml，呈濃度和時間依賴，抑制K562細胞增殖。見圖1。

圖1　YM155與Ara-C單藥分別對K562細胞增殖抑制作用

2.2YM155與Ara-C聯合和序貫方法對K562細胞增殖和凋亡的影響 聯合作用48h后CCK-8法檢測結果顯示，兩藥物聯合作用的增殖抑制率均強于單藥組及對照組，其中以YM155序貫Ara-C組的增殖抑制率最強，見圖2。流式細胞凋亡檢測結果顯示，兩藥物聯合作用48h的誘導凋亡率均強于單藥組及對照組，其中以YM155序貫Ara-C組的凋亡率最高。見圖3。

2.3聯合作用機制研究 設對照組，YM155組Ara-C組，YM155序貫Ara-C組。對4組凋亡相關蛋白的檢測結果顯示，YM155單藥作用于K562細胞后survivin及Mcl-1蛋白表達均下降，Ara-C單藥作用于K562細胞后 survivin蛋白表達輕度升高，Mcl-1蛋白表達下降，YM155序 貫Ara-C組survivin及Mcl-1蛋白表達均顯著下降，見圖4。

圖2　YM155和Ara-C單藥或聯合、序貫治療對K562細胞增殖抑制的影響

圖3　YM155和Ara-C單藥或聯合、序貫方法對K562細胞凋亡的影響

圖4　不同藥物組對K562細胞survivin 和Mcl-1蛋白表達情況

3　討論

Survivin是耶魯大學Altier實驗室在1997年發現的凋亡抑制因子，具有抑制腫瘤細胞凋亡及誘導耐藥性產生等作用，研究認為survivin高表達與CML疾病進展及耐藥密切相關［6］，故survivin是研發CML晚期患者新治療藥物的理想靶點。作者前期研究證實survivin反義寡核苷酸能誘導K562細胞凋亡及具有化療協同效應［7］。YM155是Astellas公司研發的新藥，2007年報道該藥通過抑制前列腺癌細胞系survivin mRNA及蛋白表達誘導細胞凋亡，屬新型survivin抑制劑［8］。此后研究相繼發現YM155屬細胞周期非特異性藥物［9］，與多種抗癌藥物聯合具有化療協同作用［10，11］，多中心II期研究證明該藥具有良好耐受性，但單藥僅部分有效，建議進行多藥聯合治療研究［12，13］。Ara-C屬作用于細胞周期S期的抗代謝藥物，臨床上大劑量Ara-C治療白血病易導致嚴重骨髓抑制、肺部真菌感染等并發癥，導致其臨床應用受限，故有學者開展小劑量Ara-C與其他化療藥物的聯合應用研究。但小劑量Ara-C可通過誘導細胞survivin表達增加而使體內產生獲得性Ara-C耐藥的白血病細胞群［14］，故理論分析將survivin抑制劑與小劑量Ara-C聯用，以達到降低Ara-C毒性又增加藥效的目的。

目前國內外尚無YM155在CML的機制及聯合治療研究。K562細胞系高表達survivin的人CML急變期細胞系，是體外研究抗CML急變藥物的良好細胞模型。本資料顯示YM155單藥下調K562細胞系survivin蛋白表達，抑制K562細胞生長并誘導凋亡；而YM155序貫細胞周期特異性藥物Ara-C聯合治療，抑制K562細胞增殖和誘導凋亡的作用顯著高于其他治療組，且該序貫治療顯著下調survivin及Mcl-1 蛋白表達。作者發現YM155可通過激活caspase-8下調survivin來誘導急性髓系白血病細胞凋亡［5］，據報道YM155亦可誘導腫瘤細胞自噬［15］，故未來亦可從細胞周期、caspase凋亡通路及自噬等多方面進行機制研究，YM155序貫Ara-C有可能是從多環節多靶點誘導K562細胞凋亡發揮作用。

通過科學的方法評價YM155和Ara-C各種聯合用藥方式及療效，為尋找更有效經濟的CML急變患者的聯合治療方案提供理論依據及開辟新思路。結合YM155具有低毒性及可與多藥聯合治療發揮協同效應的特點，推測其在未來CML急變患者的臨床治療中可能具有良好的應用前景。

1Li Y， Deng Z， Zhu J， et al. Homoharringtonine combined with cytarabine to treat chronic myelogenous leukemia in myeloid blast crisis and its impact on bone marrow CD34+CD7+ cells. Acta Haematol，2014， 132（2）：172～176.

2陸世豐，陸勤.硼替佐米與阿糖胞苷聯用對K562細胞增殖和凋亡的影響. 中華血液學雜志，2010，31（1）：42～45.

3封蔚瑩，周煬，鐘永根，等.SN-38對K56Z細胞的增殖抑制、凋亡誘導及其與塞來昔布聯合化療的協同作用.華中科技大學學報（醫學版），2012，41（2）：156～160.

4封蔚瑩，宋春嬌，張志堅，等.喜樹堿衍生物SN-38對人白血病細胞系HL-60增殖及凋亡作用的實驗研究.中華中醫藥學刊，2014，32（6）：1406～1408.

5Feng W， Yoshida A， Ueda T. YM155 induces caspase-8 dependent apoptosis through downregulation of survivin and Mcl-1 in human leukemia cells. Biochem Biophys Res Commun， 2013， 435（1）： 52～57. 6Reis FR， Vasconcelos FC， Pereira DL，et al.Survivin and P-glycoprotein are associated and highly expressed in late phase chronic myeloid leukemia. Oncol Rep， 2011， 26（2）：471～478.

7封蔚瑩， 周煬， 周國忠.survivin反義寡核苷酸誘導K562細胞凋亡及化療協同作用研究. 臨床血液學雜志， 2012， 25（7）： 454～456.

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9Yamanaka K， Nakahara T， Yamauchi T， et al. Antitumor Activity of YM155， a Selective Small-Molecule Survivin Suppressant， Alone and in Combination with Docetaxel in Human Malignant Melanoma Models. Clin Cancer Res， 2011，17（16）：5423～5431.

10Park DG. Antichemosensitizing effect of resveratrol in cotreatment with oxaliplatin in HCT116 colon cancer cell. Ann Surg Treat Res，2014，86（2）：68～75.

11Kaneko N， Mitsuoka K， Amino N， et al.Combination of YM155，a survivin suppressant， with bendamustine and rituximab： a new combination therapy to treat relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Clin Cancer Res，2014， 20（7）：1814～1822.

12Kelly RJ， Thomas A， Rajan A， et al. A phase I/II study of sepantronium bromide（YM155， survivin suppressor） with paclitaxel and carboplatin in patients with advanced non-small-cell lung cancer. Ann Oncol，2013， 24（10）：2601～2606.

13Cheson BD， Bartlett NL， Vose JM， et al. A phase II study of the survivin suppressant YM155 in patients with refractory diffuse large B-cell lymphoma. Cancer，2012， 118（12）：3128～3134.

14丁倩，張祥忠，鐘雪云，等.阿糖胞苷對白血病細胞K562凋亡抑制基因Survivin的作用研究. 白血病·淋巴瘤，2009，18（5）： 264～273.

15Wang YF，Zhang W，HE KF， et al. Induction of autophagy-dependent cell death by the survivin suppressant YM155 in salivary adenoid cystic carcinoma. Apoptosis，2014，19（4）：748～758.

Objective To investigate the combination effect of the survivin inhibitor YM155 and Ara-C on the proliferation and apoptosis of human leukemia cell line K562 and to explore its mechanism. Methods The K562 cells were divided into 6 groups： control group，YM155 group，Ara-C group，combination group，YM155 following Ara-C group，Ara-C following YM155 group. The cell growth inhibitory rate was measured by CCK-8 assay. The fl ow cytometry was performed to assess cell apoptosis. The apoptosis associated proteins were analyzed by Western blotting. Results The CCK-8 Methods showed that YM155 and Ara-C alone inhibited the proliferation of K562 cells. The growth inhibitory and apoptosis rates in YM155 following Ara-C group were higher than other groups. The protein expression levels of survivin and Mcl-1 decreased remarkably in K562 cells treated with YM155 following Ara-C. Conclusion The combination with YM155 following Ara-C group on K562 cells has synergistic effect. The mechanism may be related with induing apoptosis through down-regulation survivin，Mcl-1.

Survivin YM155 Cytarabine K562 cells

浙江省中醫藥科技計劃項目No.2012ZB159；紹興市公益性應用計劃項目No.2012B70066

312000浙江省紹興市人民醫院