Aurora-A在胰腺癌的表達及與吉西他濱耐藥的相關性研究

何永禮　王欣　施福田　嚴秋亮　朱錦輝★

Aurora-A在胰腺癌的表達及與吉西他濱耐藥的相關性研究

何永禮王欣施福田嚴秋亮朱錦輝★

目的 探討Aurora-A的表達與胰腺癌吉西他濱耐藥的相關性。方法 qPCR法測定PANC-1和耐藥細胞株PANC-1/R2 中Aurora-A mRNA的表達；分別用PANC-1和PANC-1/R2建立胰腺癌動物模型，免疫組化方法測定瘤體Aurora-A的表達。結果 PANC-1組模型第5周腫瘤轉移率36.8%（7/19），裸鼠體重（23.2±1.41）g，腫瘤重量（0.453±0.110）g；PANC-1/R2組模型第5周腫瘤轉移率50%（9/18），裸鼠體重（22.91±1.13）g，腫瘤重量（0.564±0.203）g。轉移率和腫瘤質量兩組比較差異有統計學意義。PANC-1組Aurora-A mRNA表達為（1.002±0.040）；PANC-1/R2組Aurora-A mRNA表達為（1.845±0.069），兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。PANC-1/R2組18例標本組織中Aurora-A蛋白陽性表達15例（83.3%）；PANC-1組19例組織的Aurora-A蛋白檢測陽性表達11例（57.9%），兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 Aurora-A基因高表達與胰腺癌細胞株的吉西他濱耐藥有關，新方法構建的PANC-1/R2耐藥株Aurora-A基因高表達，可用于胰腺癌吉西他濱耐藥研究的載體。

Aurora-A激酶 胰腺癌 多藥耐藥 吉西他濱

胰腺癌是常見的病死率較高的惡性腫瘤之一，化療效果不理想，作為胰腺癌的首選藥物的吉西他濱，其化療有效率僅25%［1］，多種耐藥是導致化療效果欠佳的重要原因。研究表明Aurora-A激酶作為一種DNA修復功能的蛋白，具有參與修復DNA的作用。目前發現在食道管癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、肺癌等中，抑制Aurora-A激酶的表達能增強腫瘤的化療敏感性［2～4］。本文探討Aurora-A激酶表達與胰腺癌吉西他濱耐藥的關系，報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物 雄性BALB/c裸小鼠由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供和飼養，鼠齡4周，體質量18～20g，飼養于恒溫（25～27℃），恒濕（45%～50%），符合SPF條件的裸鼠室內，飲用水及標準食療均經滅菌后供動物自由食用。

1.2細胞株 人胰腺癌細胞株PANC-1由浙江大學醫學院附屬第二醫院外科研究所提供。

1.3主要儀器和試劑 qPCR儀（Biorad公司），IS1000凝膠成像系統 （美國法莫西亞公司），Beckman Coul ter Avanti J-20低 溫 離 心 機（ 德 國Heraeus Inc），鼠抗人Aurora-A單克隆抗體（Santa Crus Biotechnology，Inc），Taq DNA聚 合 酶（ 日 本Takara公司），RNA酶抑制劑（美國Promega公司），ABC免疫組化檢測試劑盒（華美生物工程公司）。

1.4qPCR測定mRNA 以提取的RNA進行擴增。其引物序列及目的片段的長度見表1。qPCR程序：樣品裂解提取RNA，反轉錄制備cDNA，設定程序為兩步法Real-Time PCR，預變性95℃，1min；之后每一步變性95℃，5s；退火延伸60℃，20s；共進行40個循環。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳。選擇明亮條帶的產物進行正反向測序，電壓設定120V，電流60mA，然后在自動凝膠成像系統上成像觀察擴增結果。

表1　Aurora -A引物序列

1.5組織標本獲取 用PANC-1和PANC-1/R2 分別通過皮下移植再原位移植構建胰腺癌動物模型，每組各20例，所有裸鼠每天檢查、每周稱重，于制模后第35d稱重后處死。收集腫瘤病灶及淋巴結和內臟等標本組織。胰腺腫瘤組織在拭干表面水分后立即在電子稱上稱重并記錄，游標卡尺測量腫瘤體積并記錄。標本取下后作好標記，用預冷的生理鹽水沖洗，并將腫瘤組織1塊（用于免疫組化染色），并立即置入液氮罐中，后轉入-80℃冰箱保存。其余腫瘤組織石蠟包埋切片HE染色。所有腫瘤組織均得到病理切片證實。

1.6免疫組化 免疫組織化學染色程序按試劑盒說明書進行，磷酸緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照。Aurora-A蛋白免疫組化陽性表達定位于細胞漿，呈棕黃色顆粒。本實驗設陽性和陰性對照黃色顆粒。在光學顯微鏡下觀察全片，對切片染色陽性情況進行評估，結果判定參照文獻進行［3］。隨機選取5個高倍視野，依據陽性細胞數量、百分率，表達強度分為四級：0級：無明顯陽性反應細胞。Ⅰ級：陽性細胞＜25%、弱染色。Ⅱ級：陽性細胞在25%～75%之間。Ⅲ級：陽性細胞＞75%、強染色。0～Ⅰ級為陰性表達；Ⅱ～Ⅲ級為陽性表達。在顯微鏡下取不同放大倍數，拍照、保存結果。

1.7統計學方法 采用SPSS 14.0 統計軟件。兩樣本均數比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1 PANC-1組和PANC-1/R2組裸鼠的體重、腫瘤質量及轉移率比較 見表2。

表2　PANC-1組和PANC-1/R2組裸鼠的體重、腫瘤質量及轉移率比較（x±s）

2.2Aurora-A mRNA在 PANC-1組 和 PANC-1/ R2組中的表達 通過qPCR技術檢測PANC-1和PANC-1/R2細胞株Aurora-A mRNA的表達情況，PANC-1組Aurora-A mRNA表達是（1.002±0.040）；PANC-1/R2組 Aurora-A mRNA是（1.845±0.069），兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

2.3Aurora-A蛋白在PANC-1和PANC-1/R2組中陽性表達率比較 見表3、圖2。

圖1　兩組細胞株Aurora-A mRNA的表達情況

表3　Aurora-A蛋白在PANC-1和PANC-1/R2組中陽性表達率比較［n（%）］

圖2　Aurora-A胰腺癌陽性表達免疫組化

3　討論

Aurora-A激酶是新近發現的調節中心體、微管功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在中心體成熟、紡錘體形成、染色體分離，即有絲分裂的正常進行中發揮重要的作用。目前，Aurora-A已被認為是一個與多種惡性腫瘤發生相關的癌基因。當前眾多研究發現，Aurora-A在乳腺癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、肺癌、膀胱癌等多種人類惡性腫瘤中高表達［5，6］。其表達水平與腫瘤的組織學分級、臨床分期和患者預后具有相關性［7］。抑制Aurora-A激酶活性，可有效阻礙細胞的生長、增殖，并引起腫瘤細胞的凋亡［8］。當腫瘤細胞面對化療藥物的作用下出現DNA的損傷，而Aurora-A恰能對損傷的DNA進行修復，從而出現耐藥。研究表明Aurora-A的高表達是產生腫瘤耐藥的重要因素［9，10］。既往的研究著重于Aurora-A的表達與腫瘤及預后的關系，如Sakakura 等［11］報道，存在Aurora-A 基因擴增的原發性胃癌患者比未發現Auror a-A 基因擴增的患者預后更差。Warner 等［12］比較Aurora-A和Aurora-B 作為胰腺癌抗癌治療的分子靶點，發現以Aurora-A 為靶點治療可能在有絲分裂停滯和快速誘導程序性死亡方面，優于針對Aurora-B 為靶點的治療。但缺乏通過構建耐藥細胞株及耐藥動物模型，以此作為研究平臺評估Aurora-A表達與胰腺癌吉西他濱耐藥的關系，并評價其與轉移方式和轉移率的關系。

PANC-1/R2細胞株是通過體外培養體內誘導方式，循環兩輪后獲得的耐藥細胞株。用此細胞株和PANC-1細胞株構建胰腺癌模型，發現兩者的生物學行為并不相同，PANC-1/R2惡性程度更高，表現在該組的瘤體重量更重，而裸鼠的體重相對輕，但胰腺癌的轉移率明顯升高，達50%，而PANC-1為36.8%。提示耐藥的胰腺癌細胞的生物學惡性程度也相應提高。本資料結果表明，蛋白水平和基因水平均證實Aurora-A的表達與胰腺癌吉西他濱的耐藥有關，具體為耐藥細胞Aurora-A高表達，敏感細胞Aurora-A低表達，證實Aurora-A的表達與胰腺癌吉西他濱耐藥有關，這與文獻報道相符合。Aurora-A如何參與腫瘤的發生和耐藥產生，目前有較多觀點。認為Aurora-A過表達能夠在Cdc20-BubR1 相互作用的水平上，通過干擾有絲分裂檢測點復合物的恰當組裝導致基因不穩定和腫瘤生長［1］。目前多藥耐藥的機制尚不明確，宏觀上講與腫瘤細胞的自我吞噬增強自身抵抗力以及減少凋亡有關。Aurora-A參與自噬調節的研究不多，但已報道的研究結果表明Aurora-A可以通過自噬的途徑誘導腫瘤的耐藥。Zou［13］的研究發現Aurora-A陽性表達的乳腺腫瘤組織中自噬相關蛋白SQSTM1呈現高表達，該研究通過小分子VX-680或sRNA干擾抑制Aurora-A的表達，發現微管相關蛋白1輕鏈3-II（LC3-II）和自噬體明顯增加，而SQSTM1明顯降低；而過度表達Aurora-A則抑制自噬。Aurora-A通過負向調節自噬的途徑發揮誘導乳腺細胞自噬性的凋亡。該研究結果提示Aurora-A的高表達抑制自噬，低表達誘導自噬產生對藥物的耐藥，這與本研究結果不符合，推測自噬在耐藥產生中并非主導作用。而Hamidi［14］研究表明Nupr1通過調節Aurora-A激酶對抗因缺氧及糖饑餓引起的自噬性的細胞程序性死亡，提示非DNA損傷性的抗癌藥物耐藥可能與Aurora-A有關。p53、PP1、Cyclin B1-cdc2、BRCA1、RasGA P、Survivin、c-myc與Aurora-A的相互作用是導致胰腺癌發生耐藥的可能原因。可見，Aurora-A參與腫瘤形成及多藥耐藥的機制研究較多，機制復雜，但目前與自噬相關的較少，而其作用逐步得到認識，具有廣闊的研究前景。

1Huynh AS， Abrahams DF， Torres MS，et al.Development of an orthotopic human pancreatic cancer xenograft model using ultrasound guided injection of cells.PLoS One，2011，6（5）：e20330.

2Menke C， Goncharov T， Qamar L，et al. TRAIL Receptor Signaling Regulation of Chemosensitivity In Vivo but Not In Vitro. PLoS One，2011， 6（1）：e14527.

3El-Sheikh A， Fan R， Birks D， et al. Inhibition of Aurora Kinase A Enhances Chemosensitivity of Medulloblastoma Cell Lines. Pediatr Blood Cancer，2010，55：35～41.

4Kumano M， Miyake H， Terakawa T， et al. Suppressed tumour growth and enhanced chemosensitivity by RNA interference targeting Aurora-A in the PC3 human prostate cancer model. Br J Uri Int. 2009， 121～127.

5Wang X X， Liu R， Jin S Q， et al. Over expression of Aurora-A kinase promotes tumor cell proliferation and inhibits apoptosis in esophageal squamous cell carcinoma cellline. Cell Res，2006， 16（4） ： 356～366.

6Tanaka E， Hashimoto Y， Ito T， et al. The clinical significance of Aurora-A/STK15/BTAK expression in human esophageal squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res， 2005， 11（5）： 1827～ 1834.

7Reznikoff CA， Belair CD， Yeager TR， et al. A molecular g enetic model of human bladder cancer pathogenesis .Semin Oncol， 1996， 23（5）：571～584.

8Borges K S， Castro-Gamero A M， Moreno D A，et al. Inhibition of Aurora kinases enhances chemosensitivity to temozolomide and causes radiosensitization in glioblastoma Cells. J Cancer Res Clin Oncol，2012，138（3）：405～414.

9Tanaka E， Hashimoto Y， Ito T， et al. The Suppression of Aurora-A/ STK15/BTAK Expression Enhances Chemosensitivity to Docetaxel in Human Esophageal Squamous Cell Carcinoma. Clin Cancer Res，2007，13（4）：1331～1340.

10El-Sheikh A， Fan R， Birks D， et al. Inhibition of Aurora Kinase A Enhances Chemosensitivity of Medulloblastoma Cell Lines. Pediatr Blood Cancer，2010，55（1）：35～41.

11Sakaku ra C， H agiw ara A， Yas uoka R， et al. Tumou r-amplif iedkinaseBTAK is amplified and overex pressed in gastric cancers with possible involvement in aneu ploid formati on. Br J Cancer， 2001，84（6）： 824～831.

12Warner S L， Munoz R M， Stafford P， et al. Comparing Aurora-A and Aurora- B as molecular target s for growth in hibition of pancreatic cancer cells. Mol Cancer Ther， 2006， 5 （10） ：2450～2458.

13Zou Z， Yuan Z， Zhang Q， et al. Aurora kinase A inhibition-induced autophagy triggers drug resistance in breast cancer cells. Autophagy. 2012，8（12）：1798～1810.

14Hamidi T， Cano CE， Grasso D， et al. Nupr1-aurora kinase A pathway provides protection against metabolic stress-mediated autophagicassociated cell death. Clin Cancer Res. 2012，18（19）：5234～5246.

Objective To assess the relationship of Aurora-A expression with gemcitabine-resistance of pancreatic cancer. Methods The expression of Aurora-A mRNA of PANC-1 and PANC-1/R2 cells were tested by qPCR technique. The animal models of pancreatic cancer were estblised by PANC-1 and PANC-1/R2 cells. After 35days，mice were killed，and the tumor tissues were collected. The Aurora-A protein expression of the two groups were deteched by Immunohistochemistry. Results In the PANC-1 group，the metastasis of tumor on the fi ve weeks was 36.8% （7/19），the mean weight of tumor tissues was 0.453±0.110 g，and weight of mice was 23.2±1.41 g. While the metastasis of tumor on the fi ve weeks was 50%（9/18），the mean weight of tumor tissues was 0.564±0.203g，and weight of mice was 22.91±1.13g in PANC-1/R2 group. The metastatic rate and weight of tumor were with signifi cant differences （P＜0.05）. The expression of Aurora-A mRNA of PANC-1 cells was 1.002±0.040；while it was 1.845±0.069 in PANC-1/R2，it was signifi cant difference between the two groups （P＜0.05）. A 15 of 18 cases positive expression of Aurora-A protein were detected in PANC-1/R2 group，while it was 11 of 19 cases in PANC-1 group. The signifi cant difference was found between the two groups（P＜0.05）. Conclusions High expression of Aurora-A gene is associated with gemcitabine- resistance of pancreatic cancer cell lines. PANC-1/R2 cell was successful as a cell model of gemcitabine-resistance of pancreatic cancer.

Aurora-A kinase Pancreatic carcinoma Multiple drug resistance Gemcitabine

浙江省醫藥衛生科技計劃（2012KYB018）；浙江省中醫藥優秀青年人才基金（2013ZQ022）

321013 浙江省金華文榮醫院普外科（何永禮 施福田）321061浙江省金華市人民醫院普外科（嚴秋亮）310009 浙江大學醫學院附屬第二醫院外科（朱錦輝）310011浙江省消防總隊醫院（王欣）