長白山松子降血壓肽制備工藝優化

吳丹，劉春雷，閔偉紅，*

（1．吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春130118；2.小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林長春130118）

長白山松子降血壓肽制備工藝優化

吳丹1，2，劉春雷1，2，閔偉紅1，2，*

（1．吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春130118；2.小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林長春130118）

采用堿性蛋白酶對長白山松子分離蛋白進行酶解，以水解度和酶解物的ACE抑制率為考察指標，考察酶解pH、酶解溫度、底物濃度、加酶量4個因素的影響，通過響應面（Box-Benhnken）組合優化試驗，確定得到ACE抑制率最佳的條件為酶解pH8.9，酶解溫度55℃，加酶量7 500 U/g（以底物計），底物濃度2.5%，此時ACE抑制率為70.1%，水解度為17.5%，與模型預測值基本相符。

長白山松子；降血壓肽；ACE；抑制率

松子（Pinus konaiensis Sieb.et Zucc.）屬松科松屬植物，是一種經濟價值很高的藥食同源物質［1］。國內松子主要分為兩種，東北松子和巴西松子。現已研究松子蛋白質含量89%左右，含有17氨基酸，其中8種必需氨基酸滿足FAO/WHO規定的成人推薦值［2-3］。

植物蛋白酶解后釋放出活性多肽［4］，降血壓肽（Antihypertension Pepfide）又稱血管緊張素轉換酶（ACE）抑制肽，是酶解蛋白質產生的一類具有抑制血管緊張素轉換酶活性的多肽物質。一般含2～14個氨基酸。不同來源的降血壓肽，其相對分子質量大小和氨基酸組成不完全相同［5］。ACE抑制肽最早是Ferreira在1965年從美洲茅頭短蛇毒中發現的，隨后又從蛇毒中獲得了多種氨基酸的抑制肽［6］。源于食品的降血壓肽是一類能夠降低人體血壓的小分子多肽的總稱［7］。這些肽類食用安全性高，對血壓正常人群無降壓作用，易消化吸收，具有促進細胞增殖、提高毛細血管通透性等作用，且無副作用，可用作降壓功能性食品或藥物基料，已成為目前研究的熱點［8］。

目前少見對長白山松子降血壓肽研究的報道，本試驗以松子分離蛋白為原料，利用酶控制水解技術，通過響應面試驗組合確定制備長白山松子降血壓肽的最佳酶解條件，為長白山松子降血壓肽的理論研究和進一步的產品開發提供理論參考。

1材料與儀器

1.1材料

松子分離蛋白（蛋白含量89.69%）：實驗室自制。血管緊張素轉化酶（0.25UN）、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-Hippuryl-His-Leu hydrate，HHL）：購于sigma公司；Alcalase 2.4L FG：Novozymes公司；磷酸二氫鈉，乙酸乙酯等均為國產分析純。

1.2儀器

FD-1B-50型冷凍干燥機：北京博醫康儀器有限公司；Z36HK型高速冷凍離心機：德國HERMLE公司；FE20型pH計：瑞士梅特勒-托利多集團；UV-1700型紫外可見分光光度計：日本島津；SartoriusRSA224S型電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司等。

1.3試驗方法

1.3.1水解度（DH）測定

采用pH-stat法［9］。

1.3.2測定ACE抑制率

運用紫外分光光度計測定［10-11］。

1.3.3酶解松子分離蛋白響應面法優化試驗

采用響應曲面法的中心組合設計，以抑制率為指標對酶解條件進行優化。依據前期試驗結果確定4個因素的水平編碼如表1所示。根據試驗數據進行回歸擬合建立回歸模型。

表1　因素水平表Table 1Table of factor level

2結果與分析

2.1模型建立與分析

利用Design-Expert軟件，通過試驗數據進行多元回歸擬合見表2。

表2　Box-Behnken設計方案及試驗結果Table 2Design and results of Box-Behnken

續表2Box-Behnken設計方案及試驗結果Continue table 2Design and results of Box-Behnken

得到回歸方程為：抑制率=69.68-0.43A-0.73B+ 0.93C+9.68D-2.25AB-7.65AC-4.75AD-8.75 BC-0.35BD+5.42CD-9.04A2-13.07B2-5.01 C2-10.43D2

對抑制率方差分析結果見表3所示。

表3　回歸模型方差分析表Table 3Variance analysis of experimental results

所建立的二次回歸模型是極顯著的（Prob＜0.01），P值于越小，相應參數的顯著性越明顯［12］。失擬項0.125 5大于0.05，差異不顯著，說明其他因素對試驗結果干擾較小，模型與試驗值結果擬合較好，具有代表性；同時回歸方程的復相關系數R2=0.904 9，說明90.49%可變動性可以用該響應面模型解釋，可以利用該回歸方程對酶解工藝進行分析和預測［13］。根據回歸模型方程中各因素回歸系數絕對值大小，可知各因素影響抑制率的順序：底物濃度＞加酶量＞溫度＞pH。

2.2響應面分析及優化

根據回歸方程，作出響應面，考察擬合響應曲面的形狀見圖1。

圖1　各因素交互作用對抑制率影響的三維曲面圖Fig.1Response surface of mutual influence on the reducing power ability

分析4個因素對酶解產物ACE抑制率的影響。最大值是由橢圓輪廓圖表面上突出處預測［14］。通過Design-Expert軟件分析，得出酶解分離蛋白最佳工藝條件：pH8.9，溫度55℃，加酶量7 500 U/g，底物濃度2.5%，此條件下驗證，得到ACE抑制率為70.1%，水解度為17.5%，與模型預測值較為吻合。采用響應面法優化得到的酶解松子分離蛋白工藝條件比較可靠，具有一定的實用價值。

3結論

本試驗用堿性蛋白酶解長白山松子分離蛋白得到降血壓酶解產物，對pH、溫度、加酶量、底物濃度以ACE抑制率為指標進行響應面優化，并建立了回歸模型，方差分析表明擬合較好。優化后最佳工藝參數：pH值8.9，溫度55℃，加酶量7 500 U/g，底物濃度2.5%，酶解時間3 h。在此條件下進行驗證試驗得到ACE抑制率為70.1%，水解度為17.5%，與響應面試驗相符。本試驗研究長白山松子降血壓多肽，為今后研究松子多肽提供了理論依據和實驗數據，為長白山松子降血壓肽功能性食品的進一步開發利用提供參考。

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Preparation and Optimization of Antihypertensive Peptides from Pinus koraiensis Sieb.et Zucc Nuts in Changbai Mountain

WU Dan1，2，LIU Chun-lei1，2，MIN Wei-hong1，2，*
（1.College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，Jilin，China；2.National Engineering Laboratory on Wheat and Corn Further Processing，Changchun 130118，Jilin，China）

Pinus koraiensis Sieb.et Zucc protein isolate was hydrolyzed with alcalase to prepare antihypertensive peptides.Operating parameters such as pH，temperature，substrate concentration and enzyme dosage were optimized using response surface analysis based on degree of hydrolysis and ACE inhibitory rate.The optimum hydrolysis conditions for ACE inhibitory rate（70.1%）and degree of hydrolysis（17.5%）were found to be hydrolysis at 55℃，pH 8.9 for 3 h with an enzyme/substrate ratio of 7 500 U/g and substrate concentration of 2.5%，with the model prediction.

Changbai Mountain pine nuts；antihypertensive peptides；ACE；inhibitory activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.16.024

2014-06-16

國家“863”計劃項目（2013AA102206）

吳丹（1989—），女（蒙古），碩士研究生，研究方向：發酵工程。

閔偉紅（1971—），女，教授，博士生導師，主要從事發酵工程、糧油科學與深加工技術研究。