基于納米金生成的過(guò)氧化氫快速檢測(cè)方法

彭池方，段小慧，謝正軍，李炎

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122）

基于納米金生成的過(guò)氧化氫快速檢測(cè)方法

彭池方，段小慧，謝正軍，李炎

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122）

建立了一種基于生成膠體金的光學(xué)信號(hào)快速檢測(cè)過(guò)氧化氫（H2O2）的方法。在4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、檸檬酸鈉和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的協(xié)同作用下，H2O2可還原氯金酸，并且在不同H2O2濃度下生成不同顏色的納米金。通過(guò)肉眼觀察生成納米金的顏色，可以定性檢測(cè)H2O2，其檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.8 μmol/L。采用分光光度法分析，其檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.06 μmol/ L，檢測(cè)線性范圍為0.2～1 000 μmol/L。對(duì)牛百葉中添加10，25和100 μg/g的H2O2，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的樣品處理，其檢測(cè)回收率可達(dá)到75.2%～82.5%，相對(duì)偏差小于13%。通過(guò)肉眼觀察，對(duì)牛百葉中過(guò)氧化氫檢測(cè)限可達(dá)到25 μg/g。因此，該方法具有靈敏度高、成本低、快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，可用于各類食品或生物基質(zhì)中H2O2的檢測(cè)。

過(guò)氧化氫；食品；納米金

過(guò)氧化氫溶液俗稱雙氧水（H2O2），為無(wú)色無(wú)味的液體，因其具有高效殺菌、氧化漂白的作用。H2O2進(jìn)入人體后毒副作用極大，它會(huì)直接刺激粘膜組織，還會(huì)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致人體細(xì)胞癌變，加速人體的衰老或誘發(fā)心血管疾病等［1-3］。在食品生產(chǎn)加工過(guò)程中存在超量或非法添加H2O2，以實(shí)現(xiàn)食品防腐和增加食品的色悅感，因此，建立準(zhǔn)確、靈敏、快速的H2O2檢測(cè)技術(shù)對(duì)于食品安全具有重要意義。迄今為止，已建立的H2O2檢測(cè)方法主要包括碘量法、分光光度法、高效液相色譜法、化學(xué)發(fā)光法、熒光光度法等［4-7］。以上這些方法還存在一些缺點(diǎn)，如靈敏度不高，實(shí)驗(yàn)儀器要求較高，操作較復(fù)雜等。

納米材料所具有的氧化還原效應(yīng)、發(fā)光效應(yīng)、催化效應(yīng)等，比其他方法更快速、更靈敏，在食品檢測(cè)分析應(yīng)用中已顯現(xiàn)出其獨(dú)特的優(yōu)越性［8-11］。最近，Molly M.Stevens等［12］人利用H2O2還原氯金酸，在2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（MES）緩沖溶液的作用下，形成不同顏色的納米金，通過(guò)肉眼即可檢測(cè)H2O2，檢測(cè)靈敏度為25 μmol/L，具有方便靈敏，成本低等優(yōu)點(diǎn)，但該體系應(yīng)用于復(fù)雜食品基質(zhì)的檢測(cè)，靈敏度需進(jìn)一步提高。研究發(fā)現(xiàn)：在4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、檸檬酸鈉和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的協(xié)同作用下，H2O2可以還原氯金酸，所產(chǎn)生納米金產(chǎn)物的光吸收強(qiáng)度和顏色與H2O2濃度直接相關(guān)。基于以上發(fā)現(xiàn)，作者構(gòu)建了一種新的H2O2快速檢測(cè)方法，并將其應(yīng)用于食品中殘留H2O2的檢測(cè)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

氯金酸（HAuCl4）、檸檬酸鈉：購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；聚乙烯吡咯烷酮（PVP，平均相對(duì)分子質(zhì)量40 000）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、PEG（相對(duì)分子質(zhì)量20 000）：購(gòu)自阿拉丁試劑公司；過(guò)氧化氫及其他試劑：購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑總公司；其余試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

Biotek Eon微孔板分光光度計(jì)：美國(guó)Biotek公司產(chǎn)品；透射電鏡（JEM-2100）：日本電子株式會(huì)社產(chǎn)品；Eppendorf可調(diào)式移液器：美國(guó)艾本德產(chǎn)品；恒溫振蕩器：無(wú)錫沃信儀器有限公司產(chǎn)品；電子天平、數(shù)顯pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；XW-80A微型旋渦混合儀：金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1緩沖溶液體系的篩選移取6 μL 10.0 mmol/L氯金酸溶液，6 μL 10.0 mmol/L檸檬酸鈉溶液，以及88 μL 1.0 mmol/L的磷酸緩沖液，Tris或HEPES緩沖溶液（pH 6.5）分別加入到微孔板中；另一組緩沖液也為HEPES緩沖溶液（pH 6.5），但不含有檸檬酸鈉；每組再加入100 μL不同濃度的H2O2溶液（400.0，200.0，50.0，0 μmol/L），振蕩反應(yīng)10 min后，拍照。

1.3.2大分子聚合物的篩選及濃度優(yōu)化取6 μL 10.0 mmol/L的氯金酸和檸檬酸鈉，5 μL PVP或PEG，以及83 μL 1.0 mmol/L HEPES溶液到96微孔板中，再加入100 μL的H2O2溶液（濃度分別為400.0，200.0，80.0，20.0，5.0，0 μmol/L），將不添加大分子聚合物的反應(yīng)孔作為空白組，振蕩反應(yīng)10 min后，觀察顯色結(jié)果，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)540 nm處光吸收強(qiáng)度。選擇代表性反應(yīng)液，滴加于銅網(wǎng)碳支持膜上，由透射電鏡在200 kv電壓下獲得。

1.3.3反應(yīng)的穩(wěn)定性依照1.3.2中操作，添加5 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%PVP，加入H2O2的濃度分別為800.0，200.0，50.0，12.5，3.12，0 μmol/L，振蕩反應(yīng)10 min后測(cè)A540nm，隔5 min測(cè)一次，第30 min后隔10 min測(cè)一次，至70 min，觀察反應(yīng)時(shí)間對(duì)H2O2顯色反應(yīng)的影響。

1.3.4H2O2檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線依照1.3.2中步驟操作，加入濃度分別為800.0，200.0，50.0，12.5，3.12，0.8，0.2，0 μmol/L的H2O2，振蕩反應(yīng)10 min后，拍照，并通過(guò)酶標(biāo)儀掃描紫外吸收光譜。

1.3.5H2O2檢測(cè)方法的驗(yàn)證稱取5.0 g牛百葉，剪碎，放入三角燒杯中，添加100 μL H2O2，使其濃度分別為100，25.0，10.0 μg/g。加入50.0 mL水，振蕩5 min后，用濾紙過(guò)濾，將濾液再稀釋4倍待用。取100 μL上述牛百葉樣品液液，加入氯金酸-HEPES-檸檬酸鈉-PVP體系，振蕩反應(yīng)10 min后，檢測(cè)540 nm處光吸收強(qiáng)度。

2　結(jié)果與分析

2.1緩沖溶液對(duì)反應(yīng)顯色的影響

在含有檸檬酸鈉的常見(jiàn)緩沖溶液（PBS或Tris）中，過(guò)氧化氫不能還原，如圖1中的A、B微孔板條所示。而在HEPES緩沖溶中（圖1中D微孔板條），反應(yīng)溶液均呈現(xiàn)紅色，表明HEPES緩沖溶液對(duì)氯金酸具有較強(qiáng)的還原作用，但不同濃度的H2O2對(duì)反應(yīng)液的顏色無(wú)明顯影響。在HEPES緩沖溶液添加了檸檬酸鈉后（圖1中微孔板條E），可以發(fā)現(xiàn)，隨著H2O2濃度從高到低，顏色由藍(lán)紫色到深藍(lán)色再到淺藍(lán)色，存在顏色變化，這說(shuō)明檸檬酸鈉可以調(diào)節(jié)HEPES緩沖溶液對(duì)氯金酸具有較強(qiáng)的還原作用。值得注意的是，在檸檬酸鈉存在下，可以觀察到H2O2對(duì)氯金酸具有一定的還原作用（圖1中微孔板條C）。以上結(jié)果表明，在HEPES和檸檬酸鈉協(xié)同作用下，依靠H2O2對(duì)氯金酸的還原作用實(shí)現(xiàn)H2O2的檢測(cè)具有可行性。

圖1　不同緩沖溶液體系的反應(yīng)顯色照片F(xiàn)ig.1Photographys of coloring reaction of different buffer solution

2.2大分子聚合物對(duì)反應(yīng)顯色的影響

一些大分子聚合物，如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮等，在納米粒子生成過(guò)程中具有調(diào)節(jié)納米粒子形態(tài)、穩(wěn)定反應(yīng)體系等作用［13］。在上述氯金酸-HEPES-檸檬酸鈉-H2O2體系中嘗試添加聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮，以期進(jìn)一步改善該反應(yīng)對(duì)H2O2的特異性。如圖2所示，與沒(méi)有添加大分子的反應(yīng)體系相比，加入5 μL的體積分?jǐn)?shù)1%或2%的PEG后，后，其吸光值明顯提高，背景信號(hào)（無(wú)H2O2時(shí)）也較高，并且H2O2濃度與吸光值的線性關(guān)系不佳。有趣的是，添加了體積分?jǐn)?shù)2%PVP后，反應(yīng)體系的背景值明顯降低（肉眼可分辨），并且H2O2濃度對(duì)數(shù)與吸光值信號(hào)呈良好的線性關(guān)系。因此，后續(xù)試驗(yàn)中選擇PVP作為添加物。通過(guò)比較體積分?jǐn)?shù)0.5%～4.0%的PVP，如圖3所示：發(fā)現(xiàn)添加PVP的體積分?jǐn)?shù)為2%時(shí)，所得到的光吸收信號(hào)最強(qiáng)。

圖2　PVP、PEG對(duì)反應(yīng)體系吸光值的影響Fig.2PVP and PEG on the influence of UV absorbance of the reaction system

圖3　不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PVP對(duì)反應(yīng)體系吸光值的影響Fig.3Different concentrations of PVP on the influence of UV absorbance of the reaction system

由以上結(jié)果，推測(cè)該反應(yīng)原理如下：在檸檬酸鈉和PVP的作用下，HEPES還原氯金酸生成金納米種子，加入H2O2之后，H2O2還原氯金酸進(jìn)一步促進(jìn)金納米種子生長(zhǎng)，在低濃度H2O2時(shí)，形成納米金聚集物，溶液顏色呈藍(lán)色；在高濃度H2O2時(shí)，納米金聚集程度小，溶液顏色呈紅色（圖4）。

圖4　過(guò)氧化氫還原氯金酸反應(yīng)原理圖Fig.4Principle diagram of hydrogen peroxide reducing chloroauric acid

2.3反應(yīng)體系的穩(wěn)定性

氯金酸-H2O2反應(yīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性高，有利于降低H2O2檢測(cè)的誤差。由下圖5可看出，在初始15 min內(nèi)反應(yīng)較快，并且不同H2O2濃度之間的A540nm差值較明顯。在反應(yīng)進(jìn)行10 min后，零孔的光吸收值低于0.1，為無(wú)色，此時(shí)背景信號(hào)最低，檢測(cè)靈敏度最高。在反應(yīng)30 min內(nèi)，仍可以區(qū)分3.1 μmol/L的H2O2。隨著時(shí)間的逐漸延長(zhǎng)，12.5 μmol/L和3.1 μmol/L的H2O2信號(hào)重疊。以上結(jié)果說(shuō)明，在反應(yīng)10～30 min期間，對(duì)H2O2的靈敏度沒(méi)有明顯改變，這利于H2O2的檢測(cè)應(yīng)用。

圖5　反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系吸光值的影響Fig.5Reaction time on the influence of UV absorbance of the reaction system

2.4檢測(cè)H2O2的標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖6（a）所示，隨著H2O2濃度的增加，氯金酸-HEPES-檸檬酸鈉-H2O2反應(yīng)溶液的顏色發(fā)生有規(guī)律的變化，由淺藍(lán)、深藍(lán)到紫紅色的顏色變化。采用肉眼觀察該反應(yīng)，可以清楚地分辨0.8 μmol/L的H2O2。此方法與MES緩沖液中納米金生成檢測(cè)的方法相比H2O2，靈敏度提高了25倍［12］。圖6（b）TEM照片中的納米金分散性較好，納米粒子之間沒(méi)有大量聚集，對(duì)應(yīng)的溶液顏色為紫紅色；而圖6（c）的納米金大量聚集，這與通常納米金的聚集呈藍(lán)色，分散時(shí)呈紅色的特性相一致。分析不同H2O2濃度下生成納米金溶液的吸收光譜（圖6（d））發(fā)現(xiàn)，無(wú)H2O2時(shí)，反應(yīng)溶液無(wú)吸收峰；H2O2為0.2 μmol/L時(shí)，在570 nm處產(chǎn)生明顯吸收峰；隨著H2O2濃度的增加，納米金溶液的吸收峰逐漸藍(lán)移，在H2O2濃度為增加到800 μmol/L時(shí)，其共振吸收峰為540 nm。以上納米金溶液光譜的變化與其顏色的變化相一致。

圖6　不同濃度的過(guò)氧化氫促使形成不同顏色的金納米粒子Fig.6Generation of nanoparticle solutions with different colours depends on the concentration of hydrogen peroxide

如圖7所示，可見(jiàn)在0.2～800 μmol/L范圍內(nèi)檢測(cè)H2O2，以上反應(yīng)體系呈對(duì)數(shù)線性關(guān)系。對(duì)H2O2的檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到0.06 μmol/L（信噪比＞3）。上述H2O2檢測(cè)方法的靈敏度高于辣根過(guò)氧化物酶和磷酸銅雜化催化［14］、氧化鈰納米粒子［15］和催化性納米銀［16］等納米傳感方法；與催化性普魯士藍(lán)納米傳感的H2O2檢測(cè)方法的靈敏度相當(dāng)［14-17］。上述建立的H2O2檢測(cè)方法與這些H2O2納米傳感方法相比，不需要預(yù)先精細(xì)調(diào)控制備高性能的納米粒子，因此，H2O2檢測(cè)方法具有高測(cè)靈敏度和簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。

圖7　過(guò)氧化氫標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7Standard curve of hydrogen peroxide

2.5牛百葉樣品檢測(cè)

牛百葉是餐桌上的美味佳肴，受到許多消費(fèi)者的喜愛(ài)。牛百葉本身略帶黃色，但經(jīng)過(guò)氧化氫處理后可變得潔白，因此，檢測(cè)牛百葉中的過(guò)氧化氫對(duì)保障牛百葉的安全食用具有實(shí)際的價(jià)值［18］。對(duì)牛百葉樣品經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的處理，提取和稀釋提取液后，檢測(cè)其中的H2O2，結(jié)果如表1所示。對(duì)牛百葉中添加10，25和100 μg/g的H2O2，其檢測(cè)回收率可達(dá)到75.2%～82.5%，檢測(cè)相對(duì)偏差小于13%。檢測(cè)無(wú)添加H2O2的牛百葉樣品，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（0.8±0.12）μg/g。定義該方法對(duì)樣品的檢測(cè)限空白樣品檢測(cè)值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差。可得到該方法對(duì)牛百葉中過(guò)氧化氫的最低檢測(cè)限為1.2 μg/g。考慮到該方法所用的的樣品提取液沒(méi)有經(jīng)過(guò)復(fù)雜的預(yù)處理，可以認(rèn)為該檢測(cè)方法具有較高的準(zhǔn)確度和靈敏度。采用肉眼觀察，可見(jiàn)添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100和25.0 μg/g的樣品，最終呈明顯淡藍(lán)色；而添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.0 μg/g的樣品，肉眼難以區(qū)分其與空白樣品的差別。因此，該方法肉眼檢測(cè)牛百葉中過(guò)氧化氫的靈敏度可達(dá)到25.0 μg/g。

3　結(jié)語(yǔ)

表1　牛百葉樣品中H2O2的檢測(cè)回收率（n=3）Table 1Recovery of hydrogen peroxide in samples（n=3）

在HEPES，檸檬酸鈉和大分子PVP的協(xié)同作用下，H2O2可以還原氯金酸形成不同顏色的金納米粒子。基于上述原理建立了靈敏度的H2O2檢測(cè)方法，該H2O2檢測(cè)方法可采用肉眼觀察結(jié)果，靈敏度可達(dá)到0.8 μmol/L；采用分光光度法分析，靈敏度可達(dá)到0.06 μmol/L。以牛百葉樣品驗(yàn)證，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確性高、樣品處理方法簡(jiǎn)單。因此，該方法有望應(yīng)用于各類食品或生物基質(zhì)中H2O2的檢測(cè)。

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Rapid Detection of Hydrogen Peroxide Based on the Generation of Gold Nanoparticles

PENG Chifang，DUAN Xiaohui，XIE Zhengjun，LI Yan
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

A rapid detection method of hydrogen peroxide（H2O2）was established，which was based on the optical signal of gold nanoparticles（AuNPs）generated.With the synergetic effect of 4-（2-Hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonic acid（HEPES），sodium citrate and polyvinylpyrrolidone（PVP），H2O2reduced chloroauric acid and AuNPs of different colors were generated with different concentrations of H2O2.H2O2could thus be qualitatively detected by the naked eyes，and the sensitivity of 0.8 μmol/L was reached.By the spectrophotometry，0.06 μmol/L of H2O2could be detected with the linear range of 0.2～1 000 μmol/L.Using the method，the beef omasum samples spiked with 10，25 and 100 μg/g H2O2were analyzed with the detection recoveries of 75.2%～82.5% and relative deviation of less than 13%.Moreover，by the naked eyes 25 μg/g of H2O2in beef omasum could be detected.The developed method is therefore highly sensitive，low cost，convenient and rapid and has high application potential in the H2O2detection for various foods and biologicalsamples.

hydrogen peroxide，food，gold nanoparticles

TS 207.3

A

1673—1689（2015）10—1027—06

2014-09-16

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31371767）；國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAK08B01）；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK20141108）。

彭池方（1975—），男，湖北荊州人，工學(xué)博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事食品安全檢測(cè)與控制研究。

E-mail：pcf@jiangnan.edu.cn