Taqman探針熒光PCR檢測鯊魚源性成分

陳軒，廖秀云，陶旻，羅寶正，薄清如，沙才華，黃海超，徐海聶，楊素

（珠海出入境檢驗檢疫局國家外來病檢測重點實驗室，廣東珠海519015）

Taqman探針熒光PCR檢測鯊魚源性成分

陳軒，廖秀云，陶旻，羅寶正*，薄清如，沙才華，黃海超，徐海聶，楊素

（珠海出入境檢驗檢疫局國家外來病檢測重點實驗室，廣東珠海519015）

針對鯊魚產品摻雜造假增多而缺乏有效鑒定技術的情況，作者根據GenBank中鯊魚基因的線粒體DNA（mtDNA）序列，使用分子生物學軟件Primer Express 2.0設計了一套特異性引物和探針，用來建立Taqman探針熒光PCR檢測鯊魚源性成分的方法。結果表明，對13份已鑒定為鯊魚魚翅的樣品進行檢測，全部出現特異性擴增曲線，陰性對照沒有熒光增長。方法特異性強，對市場購買的12份鯊魚源性樣品及9份其他魚類樣品進行檢測，12份鯊魚樣品均出現熒光擴增曲線，而非鯊魚樣品均未出現熒光增長；方法靈敏度較高，可檢測到的最低質粒拷貝數量級為10拷貝/μL；方法快速準確，操作簡便，重復性好，穩定可靠，可應用于市場上魚翅等常見鯊魚源性產品的真假鑒定。

鯊魚源性成分；Taqman探針；熒光PCR；檢測

鯊魚隸屬于軟骨魚綱、板鰓亞綱、鯊總目，大約包括8目35科465多種［1］，是位于海洋食物鏈頂層的重要魚類。以鯊魚為原料的加工產品包括魚翅、鯊魚硫酸軟骨素、鯊魚肝油、鯊魚肉等，均具備一定的藥用、保健或營養價值［2，5］。近年來，由于鯊魚產品消費趨熱，鯊魚的捕殺量常年在較高水平（73～80× 104t/year，數據來源：FAO Yearbook.Fishery and Aquaculture Statistics.2012）。在巨額經濟利益的驅使下，鯊魚產品摻雜造假的情況時有發生，尤其是魚翅類產品造假更是屢見不鮮。目前對鯊魚產品的研究主要集中在鯊魚產品功能成分的提純和生物活性研究［2-4］、鯊魚產品對疾病的治療和保健機理［5-10］、鯊魚種屬鑒定［11-12］等方面，而對鯊魚產品市場所急需的鯊魚總類成分檢測與鑒定技術（非鑒定到種）的研究還較為少見，僅見郭云霞等報道了針對鯊魚源性成分建立了PCR鑒別方法和SYBR Green實時熒光PCR方法［13-14］。為維護正常市場秩序和消費者合法權益，迫切需要開發出特異性強、靈敏度高、快速準確的鯊魚源性成分檢測鑒定方法。作者利用熒光PCR特異性強、快速靈敏、簡便而不易污染等特點建立了基于Taqman探針的熒光PCR檢測鯊魚源性成分的方法。

1　材料與方法

1.1樣品

13份魚翅樣品為本實驗室留存樣品，另外12份鯊魚源性樣品（包括4份新鮮鯊魚和8份魚翅樣品）及9份其他魚類樣品（包括美洲鰻2份、日本鰻2份、龍頭魚1份、羅非魚1份、池魚1份、馬鮫魚1份、鳙魚1份）均購自珠海海鮮及干貨市場。

1.2主要試劑

DNA提取試劑盒：E.Z.N.A.TMTissue DNA Kit，美國OMEGA公司產品；TIANGEN Taq PCR Mastermix：天根生化科技（北京）有限公司產品；DNA膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、pMD 18-T、DNA Marker DL 2000：購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3主要儀器

Applied Biosystems 7500 Fast Real Time PCR System：美國ABI公司產品；Alpha Imager HP凝膠成像分析系統：美國Alpha Innotech公司產品；Sigma 3-18 K小型高速冰凍臺式離心機：德國Sartorius公司產品；NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer紫外分光光度計：美國NanoDrop Technologies公司產品。

1.4普通PCR引物及熒光PCR引物、探針的設計和合成

根據GenBank中公布的鯊魚線粒體DNA（mtDNA）序列，利用生物學軟件Clustal X比對后在高度保守區域用Primer Express 2.0分別設計了一對普通PCR引物和一套熒光PCR引物、探針，由上海輝睿生物科技有限公司合成。引物、探針序列見表1。

表1　引物和探針序列Table 1Sequences of primers and probe

1.5魚翅樣品的普通PCR擴增及種屬鑒定

按照DNA提取試劑盒說明書提取樣品DNA。以13份魚翅樣品DNA為模板進行普通PCR，并對PCR產物進行克隆測序。PCR反應體系為25 μL：2×Taq PCR Master mix 12.5 μL，100 μmol/L上下游引物各1.0 μL，DNA模版2.0 μL，補水至25 μL。反應程序：94℃2 min；94℃30 s，50℃1 min，72℃30 s，35個循環；72℃7 min。擴增結束后于質量濃度2 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將PCR產物測序比對，確定其種屬來源。

1.6熒光PCR檢測鯊魚源性成分方法的建立

以13份魚翅樣品DNA為模板進行熒光PCR擴增。反應體系為25 μL：2×Taq PCR Master mix 12.5 μL，20 μmol/L上下游引物各1.0 μL，10 μmol/ L Taqman探針1.0 μL，DNA模版5.0 μL，補水至25 μL。反應程序：94℃2 min；94℃10 s，60℃40 s（收集熒光信號），40個循環。

1.7熒光PCR方法特異性試驗

以市場購買的12份鯊魚源性樣品和9份其他魚類樣品中提取的DNA為模板，使用上述反應體系和條件進行熒光PCR擴增，驗證所建立的熒光PCR方法的特異性。

1.8熒光PCR方法靈敏度試驗

將熒光PCR產物電泳檢測后的目的條帶割膠回收，進行克隆、測序鑒定，并以此重組質粒作為陽性標準品。將重組質粒用紫外分光光度計測定質粒濃度，根據阿伏伽德羅常數換算成目的基因的拷貝數。提取陽性克隆質粒，測定濃度后，以10倍梯度稀釋到10-10，對梯度稀釋的樣本進行熒光PCR檢測。

1.9穩定性試驗

以鯊魚陽性對照為模板，使用本試驗建立的方法在兩個時間段各做20次重復，通過計算Ct值的變異系數驗證批內及批間穩定性。

2　結果與分析

2.1魚翅樣品的普通PCR擴增及種屬鑒定結果

13份魚翅樣品均被成功進行PCR擴增，產物大小約為310 bp，與預期符合（見圖1）。PCR產物經克隆測序，在GenBank中比對，確認此13份魚翅樣品均為鯊魚源性，分別來自大青鯊（4份）、犁鰭檸檬鯊（2份）、黑吻真鯊、太平洋鼠鯊、錘頭雙髻鯊、淺海長尾鯊、澳洲斜鋸牙鯊、白邊真鯊和鐮狀真鯊。

圖1　13份魚翅樣品PCR結果Fig.1PCR Results for 13 samples of shark’s fin

2.2熒光PCR檢測鯊魚源性成分方法的建立

對已確認為鯊魚翅的13份樣品均成功進行了擴增，出現了典型的S型擴增曲線，陰性對照未見熒光增長（見圖2）。反應時間較普通PCR大大縮短。

圖2　13份魚翅樣品的熒光PCR結果Fig.2Fluorescent PCR results for 13 samples of shark’s fin

2.3熒光PCR方法特異性試驗

所建立的方法對市場購買的12份鯊魚源性樣品（4份新鮮鯊魚和8份魚翅樣品）可以進行特異性擴增，而屬于其他種屬魚類的9份樣品均未見熒光增長（見圖3）。

2.4熒光PCR方法靈敏度試驗

將8個濃度梯度的陽性對照進行熒光PCR反應，可檢測到的最低質粒拷貝數為10拷貝/μL的數量級（見圖4），即為該檢測方法的靈敏度。

2.5穩定性試驗

對兩次試驗所獲得的Ct值用統計學軟件SPSS 13.0分析，批內變異系數分別為1.10%和1.22%，批間變異系數為1.32%，說明20次批內重復和2次批間重復試驗結果符合性較好，方法穩定（圖5）。

3　結語

圖3　熒光PCR方法特異性試驗Fig.3Specificity test for the method of fluorescent PCR

圖4　熒光PCR方法靈敏度試驗Fig.4Sensibility test for the method of fluorescent PCR

在現有檢測鯊魚源性成分的方法中，PCR方法具有較高的特異性和靈敏性［13］，但需要電泳檢測，結果判讀不如實時熒光PCR方便快捷，并且開蓋檢測存在污染的風險。SYBR Green實時熒光PCR方法與普通PCR方法相比具有更高的靈敏度［14］，但是由于SYBR Green熒光染料不僅能與靶基因的擴增產物結合，也可以與非特異性PCR產物結合，理論上存在假陽性的可能。TaqMan探針熒光PCR方法除了需一對特異性引物，還增加了一條與模版互補的特異性探針，探針上5'端和3'端分別標記了報告熒光基團和淬滅熒光基團，每進行一個特異性擴增循環釋放一個分子的熒光染料，非特異性產物對檢測信號沒有影響。因此，與SYBR Green熒光PCR方法相比，Taqman探針熒光PCR方法具有更高的特異性［15］，但其對探針的設計要求較高，需要由試驗驗證。作者根據GenBank中公布的鯊魚線粒體DNA（mtDNA）序列，在其高度保守區域設計了一對特異性引物和探針，實驗結果表明該引物和探針的特異性較好，對鯊魚樣品均能進行特異性擴增，并且靈敏度較高，能檢測到的最低質粒拷貝數量級為10拷貝/μL。

圖5　熒光RT-PCR重復性和穩定性試驗Fig.5Repeatability and stability test for the method of fluorescent PCR

本方法可應用于市場上常見的鯊魚產品的真假鑒定，如干魚翅、泡發魚翅、鯊魚肉、鯊魚硫酸軟骨素初級加工品等。但對于部分深加工產品，如鯊魚肝油等，由于經過較為復雜的加工過程，其DNA有可能被破壞或降解，應用可能受到一定的限制。

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Detection of Shark Derived Materials by Taqman Probe Fluorescent PCR

CHEN Xuan，LIAO Xiuyun，TAO Min，LUO Baozheng*，BO Qingru，SHA Caihua，HUANG Haichao，XU Hainie，YANG Su
（State Key Quarantine Laboratory of Exotic Animal Disease，Zhuhai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhuhai 519015，China）

As the problem of adulteration of shark products worsens and the effective detection method lacks，this study designed a set of primers and probe based on the mitochondria DNA sequences of shark published in GenBank using the software of Primer Express 2.0，so as to establish a method of Taqman probe fluorescent PCR for the detection of shark derived materials.Results showed that 13 samples that had been identified as shark fins all displayed the amplified curves.The specificity of this method was good with all of 12 shark derived samples indicating the existence of shark DNA and with no amplification curves for the other 9 samples not derived from shark species. The detection is sensitive and the minimum detectable plasmid copy number was 10 copies/μL.It isalso rapid and simple and the results have good repeatability and stability.Therefore，the method can be applied to the identification of shark derived products in marketplaces，such as fins.

shark derived material，Taqman probe，fluorescent PCR，detection

TS 254.7

A

1673—1689（2015）10—1083—06

2014-09-17

珠海出入境檢驗檢疫局資助項目（ZH2013-2）。

陳軒（1983—），男，廣東梅州人，理學碩士，高級獸醫師，主要從事動物檢驗檢疫與分子生物學檢測研究。E-mail：65561977@qq.com

羅寶正（1975—），男，山東萊西人，理學博士，研究員，主要從事動物傳染病分子診斷研究。E-mail：bzluo@163.com