浙江省“浙八味”道地藥材真菌病害調查及病原鑒定

錢永生　蔡蘇　吳劍丙等

摘要：通過對浙江省磐安地區“浙八味”藥材真菌病害進行病原菌分離和鑒定，采用無菌培養基平板分離技術，從藥材植物病葉中分離獲得病原真菌，構建真菌ITS系統發育樹，對病原菌進行分子水平的分類鑒定，并觀察病原菌菌落形態及顯微結構和形態學鑒定共獲得9種病原真菌，分別為鏈格孢菌（Alternaria sp.）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、球毛殼菌（Chaetomium globosum）、綠色木霉菌（Hypocrea virens）、月狀旋孢腔菌（Cochliobolus lunatus）、球孢黑孢霉（Nigrospora sphaerica）、木賊鐮刀菌（Fusarium equiseti）、束狀刺盤孢（Colletotrichum dematium）和莖點霉菌（Phoma sp.）。查閱藥用植物病原菌記錄并結合科赫法則實驗，當地藥用植物成為3種病原菌的新寄主，分別為月狀旋孢腔菌引起的安徽亳州白芍褐斑病、束狀刺盤孢引起的磐安闊葉麥冬炭疽病、球毛殼菌引起的早小洋菊葉枯病。

關鍵詞：“浙八味”； 中藥材； 病原真菌； ITS； 鑒定

中圖分類號：S432 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）19-4740-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.19.021

Abstract： The pathogen species and infection status in trueborn “Zhe-ba-wei” medicinal herbs were determined through investigation and identification of the pathogenic fungi in Panan region of Zhejiang province， should be provided the guide for protect medical herbs planting in large scale and eco-friend condition. Pathogenic fungi strains were separated from the infected leaves of medicinal herbs by plate separation in fertile medium. These pathogens were identified by construction of fungal ITS phylogenetic tree， and then analysis of colonial morphology and microstructure. 9 types of pathogenic fungi were finally obtained， namely Alternaria sp.， Fusarium oxysporum， Chaetomium globosum， Hypocrea virens， Cochliobolus lunatus， Nigrospora sphaerica， Fusarium equiseti， Colletotrichum dematium， Phoma sp. Compared with the related reports and Koch's postulates， the local medical herbs became new hosts for the three pathogenes. In these pathogens， Cochliobolus lunatus was the causative agent of brown spot diseases in White Paeony Root ‘An hui bozhou， Colletotrichum dematium induced anthracnose in Liriope platyphylla ‘Panan and Chaetomium globosum caused the leaf blight of Chrysanthemum‘Zao xiao yang ju.

Key words：“Zhe-ba-wei”； medicinal herbs； pathogenic fungi； ITS； identification

“浙八味”作為中國主要的出口中藥材，是浙江最具盛名的道地藥材，分別是杭白菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.）、玄參（Figwort Root）、麥冬（Liriope platyphylla）、白芍（Paeonia lactiflora）、白術（Atractylodes macrocephala）、溫郁金（Curcuma wenyujin）、浙貝母（Fritillaria thunbergii Miq.）和延胡索（Corydalis yanhusuo）8種中藥材，近年來“浙八味”藥材的品質和道地日益受到高度重視和關注[1]。

隨著“浙八味”種植數量的增加和規模的擴大，各種嚴重的病害也相繼出現，如麥冬葉枯病、溫郁金枯萎病、玄參葉斑病、白絹病等[2-4]，正嚴重威脅“浙八味”藥材生產的安全和穩定。傳統的病原菌分類方法主要根據菌株的形態特征、生理生化指標及生長特性來進行，包括形態學分類、生態學特征分類、生理學和真菌的菌體組成分類分析等，由于大部分病原菌形態特征復雜，并且少數形態特征隨著環境的變化而變化，因此，傳統的菌物分類鑒定常引起不同意見[5]。浙江磐安是中國藥材之鄉，是“浙八味”主要種植地區，種植規模大，病害也特別嚴重，一般種植人員對“浙八味”藥材病原菌多采用傳統分類鑒定方法，但因形態、地域的差異，結論并不一致，有時出現治療效果欠佳，有時可能癥狀相似，在沒確定病原菌的情況下亂試殺菌劑，增加了病原菌的抗藥性和藥材農藥殘留，對中藥品質，經濟效益和國際競爭力都會帶來負面影響[6]。因此，平常的形態鑒定有一定局限性。ITS-PCR技術廣泛應用于真菌物種的分子鑒定以及屬內物種間或種內差異較明顯的菌群間的系統發育關系分析[7，8]，本研究采用此技術并結合形態特征和光學顯微結構觀察方法對磐安地區“浙八味”藥材病原菌進行鑒定，以期為“浙八味”藥材病害進行有效防治提供科學依據，這具有重要的生態學意義和經濟價值[9]。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2013年6月，對浙江磐安中藥材種植基地“浙八味”藥材病害情況進行了調查，并收集感病葉片。所用供試材料為：紅花芍藥（Paeonia lactiflora）、早小洋菊（Chrysanthemum）、細葉白術、玄參（Figwort Root）、金菊（Chrysanthemum）2號、安徽亳州白芍（Paeonia lactiflora）、溫郁金、磐安闊葉麥冬（Liriope platyphylla）。

1.2 病原菌的分離與純化

取有病原菌部分的葉片，用無菌水沖洗4次，在無菌條件下晾干并用滅過菌的剪刀將有病原菌部分的葉片剪成1 cm×1 cm小塊，放在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）上，25 ℃恒溫黑暗倒置培養，經過48 h發現不同癥狀的葉片上有明顯的菌絲產生，再把各種不同癥狀的菌絲從培養基邊緣挑取，并轉移至新PDA平板上，重復至獲得純培養物后，將PDA斜面置于4 ℃保存。

1.3 病原菌菌落形態與顯微觀察

把前期純化保存的菌種置于新鮮PDA平板培養，至病原菌生長到離平板邊緣約5 mm時，進行外觀形態拍照記存；并在無菌條件下挑取部分菌絲置于干凈的載玻片上，用乳酸酚棉藍染色液浸染5 min，蓋上蓋玻片保存，在400×顯微鏡（Nikon 90i）下觀察拍照記存。

1.4 病原菌分子鑒定

1.4.1 DNA提取與rDNA間隔區序列的PCR擴增 DNA提取參考曹夢潔等[10]試驗方法進行，利用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）與ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），擴增病原菌rDNA ITS片段[11]，PCR反應體系見表1。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸反應45 s，35個循環，72 ℃延伸反應10 min，4 ℃保存。

1.4.2 ITS序列測定與數據分析 把經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后的PCR產物送上海桑尼生物公司進行雙向測序，獲得序列與Genbank中的核酸數據進行同源性比對[12]，試驗所獲得的病原菌與序列同源性最高的真菌為同一屬，利用MEGA 5.10軟件進行多序列匹配排列，對試驗獲得病原菌序列與數據庫中登錄的近源菌株間的真菌一起構建系統發育樹進行分析。

2 結果與分析

2.1 病原菌菌株分離結果與序列分析

“浙八味”藥材致病葉片通過PDA平板分離技術總共收集到20株病原菌樣品，通過ITS序列測定與NCBI GenBank數據庫進行BLAST比對，對獲得高同源性的序列一起通過MEGA 5.10軟件構建系統發育樹，見圖1。

從圖1中可以看出，樣品中的F13Q-2、F13D-2與登入號（GU130297.1）中的菌同源性高達100%，根據rDNA ITS 區序列分析準則[13]可初步確定該菌為肉座菌屬（Hypocrea）真菌。具有高度同源性的F13K-2、F13K-1b與登入號（JQ677042.1）中的菌聚為一支，為刺盤孢屬（Colletotrichum）真菌；F13I-2、F13Q-1與登入號（HM210092.1）中的菌聚為一支，F13E-1、F13F-2、F13P-2與登入號（AB425996.1）中的菌聚為一支，兩者同屬于鐮刀菌屬（Fusarium）；F13V-1b、F13V-1a與登入號（HQ631 000.1）中的菌聚為一小支，支持率為67%，再和F13V-3a與登入號（JQ388280.1）中的菌聚為一支，為莖點霉屬（Phoma）真菌；F13R-1、F13K-3、F13L-1、F13I-1、F13H-1與登入號（KC920885.1）中菌聚為一支，為鏈格孢屬（Alternaria）真菌；F13N-1b、F13U-1、F13A-2分別與登入號（JN689341.1、KC519729.1、DQ836800.1）中菌各聚一支，分別為毛殼屬（Chaetomium）真菌、黑孢霉屬（Nigrospora）真菌和旋孢腔菌屬（Cochliobolus）真菌。

試驗獲得20株病原菌分屬于8個真菌屬。20株病原菌的來源、GenBank登入號、測序大小、病害特征等結果見表2。

2.2 病原菌菌落形態與顯微結構

從PDA平板觀察20株病原菌，形態相似的歸為一類，總共可分為9類。并挑每類中外觀特征較好的一種菌進行拍照和顯微觀察（全自動正置熒光DIC顯微鏡及成像系統），PDA平板菌落圖和顯微結構特征見圖2和圖3。20株病原菌的原始菌落形態和顯微結構特征描述見表3。

2.3 病原菌綜合鑒定

植物病原菌種類繁多，形態復雜，對這些病原菌僅從形態學來進行鑒定，有一定的局限性[14]。基于ITS 序列的分子標記技術鑒定具有簡便、快速等特點，對屬內種間的分類鑒定具有一定的客觀合理性[15]。本研究通過ITS序列與形態、顯微結構綜合觀察，并查閱文獻，綜合確定從磐安地區部分“浙八味”藥材中共分離獲得9種病原菌，分別為鏈格孢菌（Alternaria sp.）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、球毛殼菌（Chaetomium globosum）、綠色木霉菌（Hypocrea virens）、月狀旋孢腔菌（Cochliobolus lunatus）、球孢黑孢霉（Nigrospora sphaerica）、木賊鐮刀菌（Fusarium equiseti）、束狀刺盤孢（Colletotrichum dematium）和莖點霉菌（Phoma sp.）。

3 小結與討論

“浙八味”作為著名的藥用植物，有很多功能，芍藥的提取物因含單萜苷、芍藥苷和一些酚類化合物，可以治療關節炎、肝炎[16-18]。隨著種植規模的擴大，近年來，藥用植物的真菌病害屢見報道，桑維鈞等[19]研究發現斑點葉點霉（Phyllosticta commonsii）、尖孢鐮刀菌可引起白術的葉斑病和枯萎病。陳小紅等[20]報道的玄參葉點霉（Phyllosticta scrophulariae）、炭疽菌（Colletot richum sp.）能引起玄參斑點病和芍藥炭疽病。羅有強等[2]曾報道膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）可引起山麥冬葉枯病。但隨著區域不同、季節變換，以及殺菌劑的使用，真菌病害也會有一定變化。目前，控制真菌病原體的主要方法是使用殺菌劑，但連續多年應用相同殺菌劑，使得一些真菌已經產生抗藥性[21]，因此對某一藥材主產區病害情況進行系統排查，確定突出的病原菌情況對當地的藥材生產有很大的現實指導意義。然而由于傳統的病原菌形態學鑒定方法受主觀經驗與試驗條件等影響而使鑒定工作有一定的局限性，單憑一種性狀是不可取的，只有互相驗證，互為證據，才能更全面地對病原菌形態學進行鑒定。因此，在對病原菌鑒定分類時，綜合生理學性狀、生化性狀、形態學性狀和分子學性狀等信息是一種補充手段[22，23]。隨著生物技術的發展，以ITS序列分析為代表的分子生物學方法為病原菌鑒定帶來了希望，但rDNA-ITS序列分析也受到比對使用的基因庫完善程度的影響，在基因庫缺乏與待檢病原菌親緣關系相近的已知病原菌序列時或rDNA- ITS序列上表現為極小的差異性時，ITS序列分析就會受到一定的限制[23]。因此建議將ITS序列分析結果與傳統的病原菌形態學鑒定結果（包括顯微結構和菌落形態等）相結合才能更準確地對病原菌進行鑒定，以防止偏面性。