食源性沙門菌檢測方法的研究

陳鳳仙

（羅平縣疾病預防控制中心，云南 羅平 655800）

食源性沙門菌檢測方法的研究

陳鳳仙

（羅平縣疾病預防控制中心，云南 羅平 655800）

目的 探討食源性沙門菌檢測方法。方法 人工制作食源性沙門菌污染樣品90份，分別使用傳統細菌監測方法以及酶聯免疫吸附法，對比兩種檢測方法的檢測結果。結果 在兩種檢測方法的檢測結果方面，酶聯免疫吸附法檢測結果顯著優于傳統細菌監測，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 在食源性沙門菌檢測方面，酶聯免疫吸附法能夠提高檢測速度以及準確性，從而確保受污染食品可以得到及時有效的處理，在食品衛生以及口岸檢疫等方面有重要應用價值。

食源性沙門菌；細菌檢測；食品衛生；檢疫

沙門菌可以說是感染人以及動物的一種重要病原菌，人體容易因為接觸沙門菌或者食用其污染物而感染，出現腹瀉或者系統性疾病[1-2]。目前細菌性食物中毒病例當中，沙門菌因素比例最高。沙門菌病主要成因是食用加工不夠徹底的食物，包括蛋類、肉類以及乳制品。抑制食物當中沙門菌的方法還不夠成熟，因此檢測方法在防范沙門菌食物污染以及疾病傳播領域有重要價值。在食源性沙門菌檢測過程當中，我中心使用酶聯免疫吸附法檢測進行檢測，效果理想，報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料：人工制作食源性沙門菌污染樣品90份，豬肉、雞肉以及牛奶各30份，使用傳統細菌監測方法以及酶聯免疫吸附法，對比兩種檢測方法的檢測結果。

1.2方法

1.2.1污染樣品制備方法。第一，生鮮豬肉污染樣品制備。無菌操作取無污染肌肉，將其分割成3 cm×2 cm×2 cm大小，20 g大小組織塊。使用滅菌生理鹽水稀釋培養的菌液，制成濃度各異的菌懸液，將稱好肉樣懸浮在菌懸液當中20 s完成接種，常溫靜置30 min去掉多余水分，制成濃度不同的沙門菌污染樣品。第二，雞肉污染樣品制備。無菌操作取調理雞肉，分割成為規則狀組織塊，人工污染步驟同上。第三，鮮牛奶污染樣品制備。取l5 mL過夜沙門菌懸液混入200 mL的鮮牛奶當中完成人工污染，混勻后制成牛奶污染樣品。

1.2.2細菌檢測方法。選擇污染樣品并使用抑制非沙門菌的瓊脂平板進行培養，肉眼確認平板上面的特征性菌落，之后對該菌落的分離物進行相關的生化以及血清學檢測，從而完成鑒定。

1.2.3酶聯免疫吸附法檢測方法。檢測方法：用碳酸鹽緩沖液（0.05 mol/L pH9.4)稀釋腸炎沙門菌80 g/L包被96孔酶標板，100微升/孔，用封板膜封板后置37 ℃溫育1 h。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干。取未致敏的40孔酶標板，將樣品和酶標抗體室溫作用90 min。取包被好的酶標板，小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干。將作用后的樣品與酶標抗體混合液移入包被板，每樣加兩孔，100微升/孔。留下3孔分別設陽性、陰性、空白對照。用封板膜封板后置37 ℃溫育1 h。取包被好的酶標板，小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干。取出酶標板，迅速加入50 μL終止液，加入終止液后應立即在酶標儀上測定OD490光吸收讀值。以國標法作為金標準進行ELISA方法的敏感性和特異性分析，另外采用稀釋法進行國標法和ELISA試驗的檢測限測定。

1.3統計學方法：將所檢測的數據用統計學專業軟件數據包SPSS18.0進行分析，以P＜0.05具有差異統計學意義[3]。

2　結 果

在兩種檢測方法的檢測結果方面，酶聯免疫吸附法檢測結果顯著優于傳統細菌監測，差異有統計學意義（P＜0.05），具體結果見表1。

3　結 論

3.1沙門菌檢測的意義。沙門菌是危害人與動物健康的一種重要致病菌，菌屬型別比較繁多，同時抗原也非常復雜，目前已經分離出超過60個菌群以及2000個血清型以及變種，最常見的是腸炎沙門菌。沙門菌對環境有比較強的抵抗力，在肉類、牛奶以及蛋類制品當中能夠存活數周甚至數月。在沙門菌的危害方面，該病菌被認為是最常見的一種食源性致病菌，其中食物傳播是人類主要的感染途經，肉類、蛋類、未消毒的牛奶以及海產品等食品都同沙門菌病存在一定的關系。沙門菌病臨床表現主要為惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、發熱、痙攣以及頭痛等，潛伏期6～48 h。患者往往在進食受沙門菌污染食物10～30 h后發病。可以使人類發生傷寒、副傷寒、敗血癥、胃腸炎和食物中毒，給國家經濟造成巨大損失，同時嚴重威脅著人們的身體健康。所以，沙門菌病是公共衛生學上具有重要意義的人畜共患病之一。

3.2沙門菌檢測的方法。傳統上沙門菌檢測主要使用細菌檢測法。雖然該方法較為確實，不過受貯存以及切割等方面因素的影響，食物當中的沙門菌能夠表現為間歇性以及低密度，因此很多情況下需要重復分離同時采集大量的樣品，從而在增菌肉湯當中進行培養。除此之外，傳統的細菌檢測方法全程需時3～6 d，才可以最終確定，檢驗的步驟較為復雜繁瑣。檢測人員的工作方面，挑取單菌落以及手工生化鑒定步驟都依賴工作人員的主觀判斷，所以對工作人員的經驗要求比較高，檢驗結果準確性在一定程度上受檢測人員專業素質以及實驗過程當中工作狀態的影響。酶聯免疫吸附法是在免疫酶基礎上的一種新型免疫測定技術，是目前最常見的檢測手段之一。研究結果表明酶聯免疫吸附法在沙門菌的臨床檢測中具有良好的特異性、準確性和敏感性，值得推廣使用。

綜上所述，在食源性沙門菌檢測方面，酶聯免疫吸附法能夠提高檢測速度以及準確性，從而確保受污染食品可以得到及時有效的處理，在食品衛生以及口岸檢疫等方面有重要應用價值。

[1] 鄢志剛,徐鋒,王建.食源性沙門菌快速檢測技術的應用研究[J].上海畜牧獸醫通訊,2014,12（10):19-20.

[2] 王毛,閆磊,曾慶祝.沙門菌的檢測技術與方法[J].現代食品科技, 2014,23（5):82-85.

[3] 黃素珍,杜元釗,張艷紅.檢測腸炎沙門菌EHSA方法的建立與應用研究[J].中國預防獸醫學報,2014,28（2):196-200.

圖2　益血合劑供試品HPLC圖

圖3　陰性樣品HPLC圖

烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品HPLC圖品，按含量測定項下方法制備6份供試品溶液，分別測定，計算含量，結果2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷平均含量為1.081 mg/mL，RSD值為1.23%。

表1　二苯乙烯苷加樣回收率測定結果

2.8加樣回收率試驗：取同一批次（120301）的益血合劑（無糖型）樣品（批號：120301；二苯乙烯苷含量為1.081 mg/mL），精密量取5.0 mL，共計6份，再精密加入二苯乙烯苷對照品4.70 mg，按含量測定項下方法制備6份供試品溶液，依法檢測，測定其中2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量，計算回收率，結果2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷平均回收率為97.18%，RSD值為1.49%，結果見表1。

2.9陰性試驗：取除去“制何首烏”的處方，按完全相同的制備方法制備成陰性樣品溶液，按含量測定項下方法測定。結果色譜圖中，在2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品保留時間處無任何色譜峰，表明陰性對照無干擾，結果見圖1～3。

2.10樣品含量測定及含量限度的確定：按含量測定項下方法，測定了10批“益血合劑（無糖型）”中2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量，結果見表2。

根據上述測定結果，10批益血合劑（無糖型）中二苯乙烯苷的平均含量為0.958 mg/mL，且均高于0.72 mg/mL。為有效保證制劑質量，同時考慮原料藥材產地、加工及生產等因素的影響，限定本品含制何首烏以2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（C20H22O9）計，每1 mL不得少于0.72 mg。

3　討 論

實驗中采用分光光度法[1]，以50%稀乙醇溶液為參比，在190～400 nm波長范圍內繪制吸收曲線，結果2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷在320 nm處有最大吸收，故確定本實驗的檢測波長為320 nm。

表2　樣品含量測定結果

2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷對照品及供試品溶液必須嚴格避光低溫放置，以稀乙醇定容后，需在12 h內進行測定，否則對照品及供試品溶液中的2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷均降解[2-3]。

綜上所述，本實驗建立了益血合劑（無糖型）中2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量測定的方法，和原“益血糖漿”的質量標準相比，新標準更嚴格，更規范，增強了成品制劑的可控性，也進一步保證了臨床用藥的安全和有效。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部[S].北京:中國醫藥科技出版社,2010.

[2] 陳發奎.常用中草藥有效成分含量測定[M].北京:人民衛生出版社,1997.

[3] 苗明三.現代實用中藥質量控制技術[M].北京:人民衛生出版社, 2000.

R516.3

B

1671-8194（2015）31-0032-02