擬穴青蟹抗菌肽hyastatin基因原核表達(dá)條件的優(yōu)化

彭銀輝蔡小輝，3，4熊向英劉旭佳黃國強

（1.廣西海洋生物技術(shù)重點實驗室，北海 536000；2.廣西海洋研究所，北海 536000；3.廣東海洋大學(xué)海洋學(xué)院，湛江 524088；4.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點實驗室，湛江 524088）

擬穴青蟹抗菌肽hyastatin基因原核表達(dá)條件的優(yōu)化

彭銀輝1，2蔡小輝1，2，3，4熊向英1，2劉旭佳1，2黃國強1，2

（1.廣西海洋生物技術(shù)重點實驗室，北海 536000；2.廣西海洋研究所，北海 536000；3.廣東海洋大學(xué)海洋學(xué)院，湛江 524088；4.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點實驗室，湛江 524088）

旨在優(yōu)化擬穴青蟹抗菌肽hyastatin基因原核表達(dá)條件?？寺M穴青蟹抗菌肽hyastatin基因成熟肽片段，與pET-28a表達(dá)載體連接后，轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21（DE3）中，通過優(yōu)化條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果顯示，在異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）濃度0.2 mmol/L、37℃條件下培養(yǎng)4 h 后表達(dá)量最大，分子大小與預(yù)期值相符。融合蛋白主要以包涵體形式高效表達(dá)，通過HisTrap HP柱子使其得到進(jìn)一步純化。Western blot 分析表明，該融合蛋白可與鼠抗His-tag 單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合。說明通過優(yōu)化表達(dá)條件，獲得擬穴青蟹抗菌肽hyastatin基因原核表達(dá)表達(dá)產(chǎn)物。

擬穴青蟹；hyastatin基因；原核表達(dá)；條件優(yōu)化

擬穴青蟹（Scylla paramamosain）隸屬于節(jié)肢動物門（Arthropoda）、甲殼綱（Crustacea）、十足目（Decapoda）、短尾亞目（Brachyura）、梭子蟹科（Portunidae）、青蟹屬（Scylla），具有很高的經(jīng)濟(jì)價值和營養(yǎng)價值，是中國重要海水養(yǎng)殖品種之一［1］。由于擬穴青蟹具食性廣、適應(yīng)性強、生長速度快、養(yǎng)殖周期短、耐干露時間長、易運輸和養(yǎng)殖效益高等優(yōu)點，深受養(yǎng)殖戶喜愛。隨著養(yǎng)殖強度增大以及日益惡化的養(yǎng)殖環(huán)境，擬穴青蟹養(yǎng)殖過程不斷受到包括細(xì)菌、真菌以及病毒等多種病原體的侵害［2-4］。抗菌肽具有廣譜抗細(xì)菌、抗真菌以及獨特的作用機(jī)理，在蟹類防御病原微生物入侵方面起著重要作用［5］。

抗菌肽Hyastatin是Sperstad等［6］從蛛形互愛蟹（Hyas araneus）血細(xì)胞中純化鑒定的一種對G+/G-菌、真菌均有抑制活性的新型抗菌肽，其C 端結(jié)構(gòu)域與對蝦抗菌肽Penaeidins同源，有6個保守的Cys殘基，形成3對分子內(nèi)二硫鍵，屬于Penaeidins家族抗菌肽。國內(nèi)還未見有關(guān)經(jīng)濟(jì)蟹類hyastatin 基因的克隆及其蛋白純化方面的報道。本研究將已克隆到的擬穴青蟹hyastatin基因全長序列成熟肽的編碼序列插入表達(dá)載體pET-28a，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3），構(gòu)建并優(yōu)化原核高效表達(dá)條件，對該基因所表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化，以期為其在擬穴青蟹先天性免疫中的功能及其應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體和菌株 大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）、質(zhì)粒pET-28a購至上海生工試劑，擬穴青蟹抗菌肽hyastatin基因是經(jīng)測序無誤，其克隆菌株保存于本實驗室。

1.1.2 主要試劑 PCR反應(yīng)試劑Taq DNA聚合酶、dNTP、限制性核酸內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ、T4 DNA連接酶、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、氨芐青霉素、DNA Marker、低分子蛋白Marker 及預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)相對分子質(zhì)量蛋白均為TaKaRa公司產(chǎn)品；鼠抗His-tag 單抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、DAB顯色試劑盒和DNA 膠回收試劑盒購自南寧天地?fù)P生物科技有限公司；PVDF膜購自上海生工生物技術(shù)有限公司；PCR引物均由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器 臺式高速低溫離心機(jī)（Thermo公司）、恒溫?fù)u床（常州中捷實驗儀器制造有限公司）、全溫振蕩培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)）、凝膠圖象分析儀（GDS. 8000，美國Gene公司）、蛋白純化柱HisTrap HP 1 mL預(yù)裝柱（GE公司）、小垂直板Mini Protean III電泳槽及Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽（美國Bio-Rad）等。

1.2 方法

1.2.1 目的基因表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 根據(jù)擬穴青蟹hyastatin基因全長序列（GenBank登錄號KC685376.1）設(shè)計一對特異引物，上游引物HYBDf為：5'-ccaacatatgtacaacgcgaaggttccgatc-3'（ccaa為保護(hù)堿基，下劃線為NdeⅠ酶切位點），下游引物HYBDr為：5'-ccgctcgaggcctttgtagggtactggatag-3'（ccg為保護(hù)堿基，下劃線為XhoⅠ酶切位點）。以擬穴青蟹cDNA單鏈為模板，用特異引物擴(kuò)增該基因的成熟肽片段。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃ 1 min，共34個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收目的片段。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和表達(dá)載體pET-28a分別經(jīng)Nde I和Xho I雙酶切，使用T4連接酶16℃連接4 h以上。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，挑選陽性菌落抽提質(zhì)粒，進(jìn)一步通過酶切和菌落PCR鑒定選擇陽性克隆測序，確定表達(dá)框正確。

1.2.2 不同誘導(dǎo)溫度對目的蛋白在大腸桿菌中表達(dá)量的影響 將表達(dá)正確的陽性克隆菌落，按1∶50比例接種到含卡那霉素LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD=0.4-0.6，在IPTG 濃度為0.4 mmol/L時，37℃、28℃和16℃下誘導(dǎo)4 h，分別離心收集菌體并超聲破碎，對離心后的沉淀以SDS-PAGE（濃縮膠濃度5%，分離膠濃度12%）分析目的蛋白表達(dá)的最適條件。

1.2.3 不同濃度IPTG 對目的蛋白在大腸桿菌中表達(dá)量的影響 按1.2.1培養(yǎng)細(xì)菌，取1 mL做未誘導(dǎo)對照組，分別加入不同體積的IPTG，使其終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol/L，37℃振蕩4 h后各取1 mL 菌液，以SDS-PAGE分析目的蛋白的表達(dá)量。

1.2.4 不同誘導(dǎo)時間對目的蛋白在大腸桿菌中表達(dá)量的影響 按1.2.1培養(yǎng)細(xì)菌，加入IPTG至終濃度為0.4 mmol/L，分別誘導(dǎo)0、1、2、3、4、5和6 h后收集菌液1 mL，以SDS-PAGE分析目的蛋白表達(dá)量。

1.2.5 目的蛋白的純化 將含重組質(zhì)粒的BL21菌接種于1 000 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，經(jīng)優(yōu)化的條件誘導(dǎo)后，離心收集菌體提取重組蛋白，用咪唑洗脫通過HisTrap HP柱純化重組蛋白。

1.2.6 免疫印跡分析 將誘導(dǎo)前后的含空載體和Hyastatin基因的表達(dá)菌蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，使用Mini Trans-Blot配合Mini Protean III電泳槽，將已用電轉(zhuǎn)液浸泡30 min的膠塊轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上（200 mA，80 min），用鼠抗His-tag單抗與之反應(yīng)，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，各步驟之間用含體積分?jǐn)?shù)0.1% Tween20的磷酸緩沖液（TBS）洗膜4次，每次10 min，最后用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色至有清晰的目標(biāo)蛋白帶出現(xiàn)，用無菌水終止反應(yīng)，并沖洗10 min以終止顯色，將膜置于濾紙上自然干燥。

2 結(jié)果

2.1 hyastatin基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

PCR擴(kuò)增到約390 bp的基因片段，將回收純化的目的片段連接到表達(dá)載體pET-28a，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸感染BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，挑選陽性菌落抽提質(zhì)粒，通過菌落PCR和酶切鑒定，均得到390 bp的片段，說明hyastatin基因原核表達(dá)載體構(gòu)建成功（圖1，圖2）。

圖1 重組質(zhì)粒pET28a-Hyastatin菌液PCR鑒定

圖2 重組質(zhì)粒pET28a-Hyastatin雙酶切鑒定

2.2 擬穴青蟹Hyastatin重組融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)分析

2.2.1 最佳誘導(dǎo)溫度 在其他條件一致的情況下，37℃、28℃和16℃不同誘導(dǎo)溫度下重組融合蛋白的表達(dá)量表明，37℃條件下Hyastatin全菌蛋白表達(dá)量明顯高于28℃和16℃下的表達(dá)量（圖3）。

圖3 不同溫度誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析

2.2.2 最佳誘導(dǎo)物濃度 濃度為0和0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)的重組融合蛋白表達(dá)量最少，0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)的重組融合蛋白表達(dá)量最大。濃度為0.4、0.7和1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)量較少且變化較小，這是因為誘導(dǎo)劑IPTG對細(xì)胞有毒性，高濃度IPTG不利于細(xì)菌生長，所以該融合蛋白的IPTG最佳誘導(dǎo)濃度是0.1 mmol/L（圖4）。

圖4 不同IPTG濃度誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析

2.2.3 最佳誘導(dǎo)時間 在其他條件一致的情況下，經(jīng)0-12 h誘導(dǎo)后，誘導(dǎo)時間在4 h，重組融合蛋白的表達(dá)量最高。6-10 h重組融合蛋白表達(dá)量變化不明顯，誘導(dǎo)時間過短（2 h）或過長（12 h），重組融合蛋白的表達(dá)量均較少（圖5）。

圖5 不同時間誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析

2.2.4 重組融合蛋白的純化和鑒定 最佳誘導(dǎo)條件下，即IPTG濃度0.2 mmol/L、37℃條件下培養(yǎng)4 h后，將超聲破碎后提取的包涵體上樣到HisTrap HP柱上。用咪唑緩沖液洗脫后進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果（圖6）表明，純化后的重組融合蛋白可與His-Tag單克隆抗體結(jié)合，表現(xiàn)出與融合蛋白大小一致的條帶，大小與SDS-PAGE中誘導(dǎo)后出現(xiàn)的條帶吻合，結(jié)合測序結(jié)果可推斷，已成功表達(dá)擬穴青蟹Hyastatin多肽。

圖6 用His-Tag單克隆抗體進(jìn)行Western blot分析

3 討論

原核表達(dá)是與外源基因表達(dá)系統(tǒng)的常見方法，它具有操作簡單、成本低、表達(dá)效率高、產(chǎn)物穩(wěn)定且易鑒定等優(yōu)點。一個高效的原核表達(dá)體系的構(gòu)建，不僅涉及宿主、載體和外源基因三者之間的關(guān)系，還受誘導(dǎo)條件的影響［7，8］。本實驗選用常用抗原蛋白表達(dá)載體pET-28a（+）作為表達(dá)載體，其N、C端帶有His-Tag，有利于表達(dá)蛋白純化。將編碼擬穴青蟹抗菌肽hyastati蛋白活性核心區(qū)的堿基序列插人pET-28a載體，成功獲得重組融合蛋白。通過HisTrapHP親和層析柱，可從包涵體中分離得到純度較高的重組融合蛋白，為抗菌肽hyastatin基因在擬穴青蟹獲得性免疫中的作用及應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

研究表明，原核表達(dá)體系中，誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度及表達(dá)時間對誘導(dǎo)蛋白影響較大［9-11］。本實驗通過固定其它條件，對單個因子如時間、濃度IPTG和溫度的誘導(dǎo)表達(dá)后，獲得整體的優(yōu)化。溫度在誘導(dǎo)過程中除影響氧的溶解度外，還會加速或延緩酶的反應(yīng)速率，影響蛋白的性質(zhì)。本研究中，最佳誘導(dǎo)溫度37℃時蛋白表達(dá)量最高，28℃和16℃下的表達(dá)量依次減少。0.1-1 mmol/L范圍內(nèi)的IPTG均可誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，在降低IPTG對細(xì)菌代謝的毒性作用和減少費用前提下，確定其最低有效濃度為0.2 mmol/L。誘導(dǎo)時間在0和2 h表達(dá)量較少，誘導(dǎo)4-10 h表達(dá)量變化不明顯，誘導(dǎo)12 h表達(dá)量出現(xiàn)減少，可能與細(xì)菌生長到平臺期或死亡期后菌體自溶釋放蛋白酶降解一部分蛋白有關(guān)。本研究通過優(yōu)化原核表達(dá)條件，得出IPTG濃度0.2 mmol/L、37℃條件下培養(yǎng)4 h后表達(dá)量最大，分子大小與預(yù)期值相符。這些結(jié)果為重組蛋白的大量純化提供可靠實驗依據(jù)。

本研究中重組蛋白主要以包涵體形式存在于表達(dá)產(chǎn)物中。包涵體的存在會影響目的蛋白的純化，但包涵體形式可以保護(hù)蛋白質(zhì)免受蛋白酶水解，而且利用包涵體的不溶性和致密性，通過離心即相對容易地對之進(jìn)行提取［12］。包涵體在純化過程中是否得到復(fù)性，是否需溶解復(fù)性才能回收正確折疊的重組蛋白還有待于進(jìn)一步研究。Western blot結(jié)果顯示，純化的hyastatin基因表達(dá)融合蛋白可與鼠抗Histag單抗發(fā)生特異性結(jié)合，說明獲得了融合蛋白的表達(dá)產(chǎn)物，為該蛋白在獲得性免疫中的功能研究奠定基礎(chǔ)。

養(yǎng)殖過程中因細(xì)菌、病毒和其它致病因子經(jīng)常給擬穴青蟹育苗和養(yǎng)殖造成極大的經(jīng)濟(jì)損失［13-15］。在病原感染早期，擬穴青蟹只能依賴先天性非特異免疫，識別和清除入侵微生物，維持機(jī)體健康。因此，抗菌肽類產(chǎn)品有望在促進(jìn)免疫應(yīng)答，提高機(jī)體自身的抗病能力方面大顯身手。目前，研究人員對青蟹抗菌肽hepcidin、scygonadin以及CrusSp等基因進(jìn)行了克隆表達(dá)及抑菌活性分析［16-18］，而擬穴青蟹抗菌肽hyastatin基因原核表達(dá)未見報道。本研究成功獲得了擬穴青蟹抗菌肽hyastatin基因的重組蛋白，這為后續(xù)工作如純化蛋白、批量獲取純化蛋白、抗體制備等提供前期條件，為進(jìn)一步更深入地研究其功能、免疫機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究通過克隆擬穴青蟹抗菌肽hyastatin基因成熟肽片段，構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)后進(jìn)行優(yōu)化表達(dá)，在IPTG濃度0.2 mmol/L、37℃條件下培養(yǎng)4 h后表達(dá)量最大，成功獲得目的表達(dá)產(chǎn)物。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Optimization of Prokaryotic Expression of Antibacterial Peptide hyastatin Gene in Scylla paramamosain

Peng Yinhui1，2Cai Xiaohui1，2，3，4Xiong Xiangying1，2Liu Xujia1，2Huang Guoqiang1，2
（1. Guangxi Key Laboratory of Marine Biotechnology，Beihai 536000；2. Guangxi Institute of Oceanology，Beihai 536000：3. Marine College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088：4. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals，Zhanjiang 524088）

This study aims to optimize the prokaryotic expression of hyastatin gene in Scylla paramamosain. The fragment of cloned mature peptide in S. paramamosain hyastatin was ligated with the expression vector pET-28a. This recombinant was transformed into Escherichia coli BL21（DE3）， and the gene was expressed by inducing under the optimal conditions. The expression of this protein was the highest under the 37℃ and in 0.2 mmol/L of IPTG for 4 hours. The molecular weight of the expressed product was identical to that of expected protein by SDS-PAGE analysis. The fusion protein was efficiently expressed as inclusion bodies， and further purified by HisTrap HP column. The result of Western blot showed that the fusion protein could be bound specifically with mouse anti-His-tag Mab. In conclusion， the prokaryotic expression product of hyastatin gene in S. paramamosain may be obtained by optimizing expression conditions.

Scylla paramamosain：hyastatin gene：prokaryotic expression：condition optimization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.020

2014-11-03

廣西自然科學(xué)基金資助項目（桂科自2010GXNSFA013079），廣西科技攻關(guān)資助項目（桂科攻1114012-11）

彭銀輝，男，碩士，研究方向：海水養(yǎng)殖；E-mail：pyinhui@163.com

黃國強，男，博士，研究方向：海水養(yǎng)殖與生理生態(tài)；E-mail：hgqhugq@yahoo.com.cn