響應面優化丙酮粉法提取金銀花多酚氧化酶

屈政 羅磊 楊彬 康新艷

（河南科技大學食品與生物工程學院，洛陽 471023）

響應面優化丙酮粉法提取金銀花多酚氧化酶

屈政 羅磊 楊彬 康新艷

（河南科技大學食品與生物工程學院，洛陽 471023）

對丙酮粉法提取金銀花多酚氧化酶的工藝進行研究，結果表明，緩沖液pH、料液比、提取時間對PPO比活力影響顯著。緩沖液pH與料液比交互作用極其顯著，回歸模型擬合性良好（R2=99.31%）；影響顯著順序為：靜置時間＞緩沖液pH值＞料液比；最優化工藝參數為：緩沖液pH7.5，料液比為1∶120，提取時間為14.5 min。在此條件下，酶比活力為137.389 U/mg。

金銀花；多酚氧化酶；丙酮粉；提取；響應面

傳統中醫理論認為金銀花具有清熱解毒、疏利咽喉、消暑除煩的功效。新鮮金銀花含水量約為80%，顏色嫩綠，但新鮮金銀花不利于運輸及儲存，必須及時干燥。干燥過程極易造成金銀花外觀顏色嚴重褐變，同時，其主要功效成分綠原酸和木犀草苷含量明顯下降，金銀花藥用價值損失很大［1］。為探究金銀花在干燥過程中酶促褐變的機理，有必要提取分離高純度的PPO作酶學性質的相關研究。

目前，PPO提取方法有勻漿法和丙酮粉法。勻漿法操作簡單，所得酶液活性較強，但多酚類物質殘留量較高，酶液純度偏低。丙酮粉法主要是通過丙酮使細胞膜的磷脂結構破壞，從而改變細胞膜的通透性，再經過提取可使膜結合的PPO或胞內的PPO釋放出胞外。相對于勻漿法而言，其酶粉活性尚可、體積小且便于貯存，可直接應用［2］。田玉庭［3］曾用丙酮粉法提取澳洲青蘋PPO，經初步純化后，SDS-PAGE凝膠電泳檢測僅顯示一條電泳帶。Ben-Shalom等［4］用丙酮粉法提取橄欖果實中的PPO，也取得了良好的效果。目前，尚未有響應面優化丙酮粉法提取金銀花多酚氧化酶的相關研究報道，本研究對其進行初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料

無損傷、未開花、品質良好的新鮮金銀花，購于河南省孟津縣益豐金銀花生產基地，品種為金豐一號。丙酮、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸、氫氧化鈉、鄰苯二酚、考馬斯亮藍G-250、牛血清蛋白。以上均為分析純。

飛利浦HR2850攪拌機、天孚DT510L電子天平、湘儀H1850R冷凍離心機、SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿易有限公司；DYY-6C電泳儀，北京市六一儀器廠；UV2400紫外可見分光光度計，舜宇恒平科學儀器有限公司；PHS-3C PH計，上海越平科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酶的提取 10 g樣品加入一定體積-20℃ 丙酮中，打漿1 min（打10 s停5 s），迅速用布氏漏斗抽濾，將濾餅溶于冷凍丙酮中反復抽濾，至濾餅無色為止。將濾餅置于培養皿中，在室溫下干燥，待丙酮完全揮發后，即得丙酮粉。丙酮粉溶于一定pH磷酸鹽緩沖液中，靜置若干時間，用八層紗布過濾后在凍離心機中離心，取上清液，即為PPO粗酶液［5］。

1.2.2 酶活力的測定 向3 mL pH 7.0的磷酸鹽緩沖液和1 mL 0.01 mol/mL的鄰苯二酚的混合溶液中加入1 mL PPO粗酶液，混合均勻后，測定其在2 min內420 nm下的吸光度，從加入粗酶液開始計時，每10 s記錄一次OD值，用PBS和鄰苯二酚混合液為參比，通過最初直線段較穩定的斜率來計算PPO活力［6］。一個酶活力單位（U/mL）定義為：每單位時間內引起吸光度改變0.001所需的酶量。

其中，A：吸光度的變化量；Vr：加樣緩沖液總體積（mL）；Vs：取樣比色體積（mL）；W：取樣質量（g）。

1.2.3 蛋白質濃度的測定 采用Bradford考馬斯亮藍法測定PPO含量，用牛血清蛋白制作標準曲線［7］，標準曲線方程為：

其中，y：吸光度，x：蛋白質質量濃度（mg/mL）。

1.2.4 PPO比活力的測定 PPO比活力是指每毫克PPO所具有的活力數。比活力越大，表示PPO的純度越高［8］。計算公式如下：比活力=活力（U/mL）/蛋白質質量濃度（mg/mL）。

1.2.5 單因素試驗

1.2.5.1 緩沖液pH值的選擇 按料液比為1∶100，取1 g丙酮粉，分別加入100 mL pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的PBS中，靜置30 min后，8 層紗布過濾。用高速冷凍離心機在4℃、10 000 r/min的條件下離心15 min，分別測定上清液中酶的比活力。

1.2.5.2 料液比的選擇 取1 g丙酮粉，分別加入60、100、140、180、220 mL pH為7.5的磷酸鹽緩沖液中，靜置30 min后，8層紗布過濾。用高速冷凍離心機在4℃、10 000 r/min的條件下離心15 min，分別測定上清液中酶的比活力。

1.2.5.3 提取時間的選擇 取1 g丙酮粉，加入料液比1∶100，pH為7.5的磷酸鹽緩沖液中，分別靜置0 min、30 min、1 h、1.5 h、2 h后，八層紗布過濾。用高速冷凍離心機在4℃、10 000 r/min的條件下離心15 min后，測定各上清液中酶的比活力［9-11］。

1.2.6 丙酮粉法提取金銀花PPO工藝響應面實驗 根據單因素實驗結果，以緩沖液pH值、料液比、提取時間構建二元回歸模型，采用響應面分析方法對提取金銀花PPO比活力大小的影響進行分析。

2 結果

圖1 緩沖液pH值對PPO比活力的影響

2.1 緩沖液pH值的影響

由圖1可知，不同pH值的磷酸鹽緩沖液提取金銀花PPO丙酮粉，所得PPO比活力有明顯的差異。當pH小于7.5時，PPO比活力隨著緩沖液pH值的增大而增大。當pH到達7.5時，PPO比活力到達一個峰值。當pH大于7.5時，PPO比活力出現明顯下降的趨勢。

2.2 料液比的影響

由圖2可知，當料液比大于1∶100時，PPO比活力隨著料液比的增加上升明顯，當料液比小于1∶100時，PPO比活力出現了略微下降的趨勢后基本保持不變。

圖2 料液比對PPO比活力的影響

2.3 靜置時間的影響

由圖3可知，隨著提取時間的延長，PPO比活力逐漸增加，15 min時達到峰值。隨著提取時間的繼續增加，PPO比活力開始下降。可能的原因是隨著提取時間的增加，越來越多的PPO溶入到了緩沖液中，比活力隨之增加。當在某一時間，PPO完全溶入緩沖液后，隨著提取時間的繼續增加，受提取環境的影響，本身構相并不穩定的PPO活力開始下降，因此比活力逐漸降低。

圖3 提取時間對PPO比活力的影響

2.4 響應面試驗設計與分析

2.4.1 響應面因素水平的選取 綜合單因素實驗結果，緩沖液pH值、料液比、提取時間三因素對金銀花PPO的比活力有較為明顯的影響。根據Box-Behnken的原理，在單因素數據結果的基礎上，采取三因素三水平響應面實驗設計分析方法，實驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗設計的因素和水平

2.4.2 響應面試驗設計與結果 以pH值（X1）、料液比（X2）、提取時間（X3）為自變量，以比活力（Y）為響應值，設計實驗方案及結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果

2.4.3 回歸方程的建立與檢驗 表2中17個實驗選擇分為響應面的析因點和零點，其中序號1到12的實驗為析因試驗，13到17為中心實驗。析因點自變量在由X1、X2、X3因素所構成的三維頂點上取值，零點則在對應區域的中心點。一般情況下，零點實驗要重復進行5次，以便于實驗的估計誤差。由于各因素對比活力的影響均不是簡單的線性關系，所以采用Design-Expert軟件對表2的響應值分別進行多元回歸擬合，并確定各因素對響應值的影響。各因素回歸擬合后，響應變量Y對pH值、料液比、提取時間的二次多項回歸模型如下：

表3 回歸模型方差分析表

2.4.4 回歸方程的參數評估 由表4可知，X1、X3、對提取金銀花PPO比活力影響極顯著，X2對提取金銀花PPO比活力影響顯著。其中，三因素對提取金銀花中PPO比活力影響的主次順序是pH值＞浸提時間＞料液比。

表4 回歸模型系數顯著性檢驗表

2.4.5 最佳提取工藝的優化及驗證 通過Design-Expert的最優化模型回歸分析，得到最佳的提取工藝條件為，pH7.49，料液比1∶120、靜置時間為14.37 min，此條件下PPO酶的比活力的預測值為137.389 U/mg。為便于實際操作，把最佳提取工藝修正為pH 7.5，料液比1∶120、靜置時間為14.5 min。

為驗證響應面法優化結果的可靠性，在修正條件下，采用丙酮粉法對金銀花PPO進行了提取，進行5次驗證試驗，得到平均比活力為131.732 U/mg，結果與預測值相近。驗證表明，擬合模型對于提取金銀花PPO比活力的影響有較好的預測能力。

3 討論

3.1 緩沖液pH值對PPO比活力的影響

PPO在弱堿性條件下構相穩定性最高，活性最大［12］；而在酸性或者強堿性條件下，PPO會聚集、變性，從而影響比活力。

3.2 料液比對PPO比活力的影響

料液比過高，使丙酮粉未能完全溶于緩沖液中，提取不徹底造成PPO比活力不高。隨著緩沖液體積的增加，丙酮粉中的PPO開始逐漸完全的溶入到緩沖液中，從而比活力增加［13］。當料液比達到一定值時，丙酮粉中PPO和緩沖液的溶合達到一種平衡狀態，當料液比繼續增加時，PPO可能會從緩沖液中溶出，造成比活力的降低［14］。

3.3 靜置時間對PPO比活力的影響

隨著提取時間的增加，越來越多的PPO溶入到了緩沖液中，比活力隨之增加。當在某一時間，PPO完全溶入緩沖液后，隨著提取時間的繼續增加，受提取環境的影響，本身構相并不穩定的PPO活力開始下降，因此比活力逐漸降低。

3.4 回歸方程的方差分析

對該模型進行方差分析（表3），模型的F值為111.93，P值＜0.001，遠小于一般顯著性檢驗規定（P＜0.05為顯著，P＜0.01為極顯著），說明二次多項式模型極顯著；失擬項的P值0.5354＞0.05，說明模型失擬度不顯著。回歸方程的擬合度還可通過擬合優度R2和調整后擬合優度adjR2來驗證，二次多項式的模型的預測值與試驗真實值之間的相關性達99.31%，調整擬合優度98.42%，表明該模型能夠解釋98.42%響應值的變化，模型擬合程度良好。故可用此模型對丙酮粉法提取PPO粗酶液的比活力的大小進行分析和預測。

3.5 響應面交互作用分析

如圖4所示，X1、X2在不同程度上對PPO比活力有影響，且二者交互作用極為顯著，可能是pH影響酶液的總酶活，料液比影響酶液中酶的濃度。二者的變化，引起了PPO比活力的變化；或者是料液比對酶濃度的影響隨著pH值的變化而變化，進而影響PPO比活力的變化。X1、X3對PPO比活力影響最大，但二者交互作用卻不顯著，可能是pH對酶活性的影響和提取時間對酶濃度的影響的差異不顯著。X2X3亦是如此。

圖4 緩沖液pH值與料液比pH與靜置時間、料液比、與靜置時間交互作用的響應面和等高線

3.6 勻漿法和丙酮法的對比研究

有文獻報道，羅磊等［7］曾用響應面優化勻漿法提取金銀花中PPO酶，得到酶的比活力為654.998 U/mg。丙酮粉法雖然對酶活性損失較大，但其酶粉活性尚可，且純度較高，可直接應用，并為研究PPO酶學性質打下了良好的基礎。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳對羅磊優化的勻漿法和本試驗優化的丙酮粉法提取的粗酶液進行檢測［18］，結果顯示丙酮粉法提取的酶液清晰，在沒有進一步提純的條件下僅有4條譜帶；勻漿法提取的酶液譜帶較多，且不清晰。由此可見，勻漿法的酶液含有較多的雜蛋白，而丙酮法提取的酶液蛋白純度較高。因此，為了進一步研究金銀花在干燥過程中的褐變機理，應選用丙酮粉法。

4 結論

由單因素試驗可知，緩沖液pH值、料液比、提取時間對PPO比活力有顯著的影響。構建的二次回歸模型，擬合性良好，驗證了三因素對PPO比活力影響顯著。其中pH值和靜置時間極其顯著、pH值和料液比交互作用極其顯著。

優化條件為緩沖液pH 7.5，料液比為1∶120，靜置時間為14.5 min，并與驗證試驗相符。經電泳檢測，丙酮粉法提取酶液純度較勻漿法高，因此選用丙酮粉法提取金銀花PPO。

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（責任編輯 李楠）

Optimizing the Method of Acetone Powder to Extract Polyphenoloxidase from Honeysuckle Using Response Surface Methodology

Qu Zheng Luo Lei Yang Bin Kang Xinyan
（College of Food and Bioengineering，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471023）

In this study， the method of acetone powder was optimized to extract the polyphenoloxidase（PPO）from honeysuckle flowers（Lonicera japonica）by response surface methodology. The results showed that three operating parameters had great effects on the PPO specific activity， and their effects were ranked as follows：extraction time ＞ buffer pH ＞ material-to-liquid ratio. The established regression model was highly fitting（R2= 99. 31%）， and the interaction effect between buffer pH and material-to-liquid ratio was extremely significant. The optimal extraction condition was pH 7. 49， material-to-liquid ratio 1∶120 and extraction time 14. 5 min， under which the PPO specific activity was 137. 389 U/mg.

Lonicera japonica；polyphenoloxidase；acetone powder；extract；response surface

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.031

2014-11-18

國家自然科學基金（U1304330）

屈政，男，碩士研究生，研究方向：天然活性物質的提取；E-mail：402526581@qq.com

羅磊，男，博士，副教授，研究方向：天然活性物質；E-mail：13623896431@139.com