日本鰻鱺I型Cathelicidin基因的克隆與原核表達

張東玲喻達輝

（1. 集美大學水產學院 鰻鱺現代產業技術教育部工程研究中心，廈門 361021；2.中國水產科學研究院南海水產研究所，廣州 510300）

日本鰻鱺I型Cathelicidin基因的克隆與原核表達

張東玲1喻達輝2

（1. 集美大學水產學院 鰻鱺現代產業技術教育部工程研究中心，廈門 361021；2.中國水產科學研究院南海水產研究所，廣州 510300）

Cathelicidin是目前發現的一個最大抗菌肽家族，具有多重生物學功能。旨在探索和利用魚類Cathelicidin抗菌機制和潛在的生物學功能。應用RACE-PCR技術獲得日本鰻鱺I型Cathelicidin（AjCathI）基因的cDNA全長序列。AjCathI的cDNA全長為842 bp，開放閱讀框為570 bp，編碼189個氨基酸。氨基酸序列分析表明，AjCathI靠近C端有4個保守的半胱氨酸序列，抗菌成熟肽與香魚（Plecoglossus altivelis）抗菌成熟肽相似性最高，同源性為65.57%。進化分析表明，AjCathI與其它魚類親緣關系較近，處于同一個分支上。將AjCathI基因克隆至pET-28a載體，轉化Escherichia coli BL21（DE3）宿主菌進行表達。結果表明，AjCathI以包涵體形式表達，經鎳柱純化、Western blot驗證和透析復性，獲得高純度的重組蛋白。

日本鰻鱺；Cathelicidin；抗菌肽；RACE-PCR

抗菌肽又稱宿主防御肽，作為生物體非特異性免疫的一個重要組成部分，是宿主防御細菌、病毒等病原生物體入侵的重要分子屏障，廣泛分布于動植物、昆蟲和細菌等多種生物體內。Cathelicidin是目前發現的一個最大抗菌肽家族，不同的Cathelicidin前體肽結構相似，包括pro、pre和C端成熟肽3個區域。Pro區又稱信號肽區，引導小肽進入細胞內部；Pre區為結構域，包含一個高度保守的cathelin區，4個半胱氨酸靠近C端形成兩個分子內二硫鍵，直接影響到整個分子的結構；C端成熟肽是一個高度變異的抗菌區域。Cathelicidin在信號肽的引導下進入細胞內部，然后切除pro區域，剩下C端成熟肽發揮抗菌功能。迄今，已陸續在盲鰻（Myxin eglutinosa）［1］、大西洋鮭（Salmo salar）［2］、大西洋鱘（Gadus morhua）［3，4］、茴魚（Thymallus thymallus）［5］、香魚（Plecoglossus altivelis）［6］等多種魚類確認了Cathelicidin類抗菌肽的存在。但在鰻鱺還未見該抗菌肽的報道，因次，有必要深入研究該抗菌肽的結構和功能。

我國是世界上主要鰻鱺生產國之一，在多年的養殖過程中，病害發生較為頻繁，病原復雜，其中以細菌性和寄生蟲疾病最為嚴重［7，8］。鰻鱺人工養殖過程中多采用化學類藥物，如抗生素等，導致細菌和寄生蟲耐藥性增強、水產品藥殘超標及對水環境污染，這些均嚴重制約著我國鰻業的健康發展［9］。抗菌肽的制備主要有天然材料提取、化學合成和基因工程表達3種方法，但抗菌肽天然提取原料有限，產量低，提取過程又非常復雜。化學合成成本高，價格昂貴，不利于投入實際應用。因此，借助成熟的基因工程技術獲得抗菌肽，開發藥用價值，是比較切實可行的方法。Cathelicidin抗菌肽具有高效廣譜的抗菌活性和不易產生耐藥性等特點，可在魚病防治中起重要作用，因此倍受關注。本研究克隆和原核表達純化日本鰻鱺Cathelicidin，以期為有效控制鰻鱺細菌性疾病提供新途徑，同時也為魚類抗菌肽的研究提供重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 pMD18-T 載體購自TaKaRa公司；pET-28a載 體、 大腸 桿 菌（Escherichia coli）DH5α、大腸桿菌BL21（DE3）均由本實驗保存。

1.1.2 主要試劑 SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit 購自Clontech公司；PVDF膜為Roche公司產 品；TRIZOL?Reagent Total RNA Isolation Reagent購自Invitrogen 公司；DAB染色試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司；丙烯酰胺、N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺為BBI 公司產品；二硫蘇糖（DDT）、過硫酸銨、TEMED為Amresco公司產品；SDS-PAGE低分子量標準蛋白質Marker、預染Marker購自Fermentas公司；咪唑為Sigma公司產品；Western blot 一抗（His·Tag單抗）為Roche公司產品；二抗（山羊抗鼠IgGAP）購自上海捷瑞生物工程有限公司；胰蛋白胨、酵母粉、氯化鈣、氯化鈉、無水乙醇、Trisbase、尿素、磷酸氫二鈉等其它常用試劑均為國產分析純。

1.1.3 實驗動物 日本鰻鱺：購自集美大學海水養殖試驗場，體重約300 g，外觀無明顯病變和損傷。

1.2 方法

1.2.1 日本鰻鱺AjCathI基因cDNA的克隆與序列分析 采用Trizol試劑盒并按照說明提取日本鰻鱺肝臟總RNA，提取的總RNA用1%瓊脂糖電泳檢測完整性。

以RNA為模板，SMARTer IIA oligo和5'- RACE CDS Primer A為反轉錄引物（表1），采用SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit反轉錄cDNA。根據日本鰻鱺的AjCathI EST（GenBank：HS106475，ttp：//www.ncbi.- nlm.nih.gov/）， 設 計 引 物 擴 增AjCathI基因5'端。以cDNA為模板，5CR1和UPM為引物第一輪PCR擴增，反應程序為：94℃預變性2 min；94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸2 min，共25個循環；最后72℃延伸5 min。隨后以第一輪PCR產物為模板，5CR2和Nest為引物第二輪PCR擴增，反應程序為：94℃預變性2 min；94℃變性30 s，70℃退火2 min，5 個循環；94℃變性30 s，68℃退火30 s，72℃延伸2 min，25 個循環；72℃延伸5 min。

用DNA膠回收試劑盒回收AjCathI基因的PCR產物，連接于克隆載體pMD18-T，構建pMD-AjCathI質粒并轉化至DH5α感受態細胞，經PCR陽性克隆鑒定后送Invitrogen公司測序。

1.2.2 日本鰻鱺AjCathI原核表達載體的構建 根據已獲得的日本鰻鱺AjCathI cDNA序列及pET-28a（+）多克隆位點，設計引物CF和CR（表1），引物分別加入Nco I和Xho I酶切位點。以日本鰻鱺AjCathI（cDNA）重組pMD18-T陽性質粒為擴增模板，以CF、CR為上下游引物，用pfu高保真Taq酶擴增目的片段。PCR反應程序：94℃預變性2 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環；72℃延伸5 min。PCR產物電泳回收純化后，經Nco I和Xho I雙酶切后，克隆于表達載體pET-28a（+），轉化至DH5α感受態細胞，并利用卡那霉素抗性平板篩選陽性克隆，經PCR陽性克隆鑒定后送Invitrogen公司測序。

1.2.3 重組蛋白誘導表達條件的優化與表達形式的鑒定 經測序準確后，將攜帶目的基因的pET-28a/ AjCathI的重組質粒轉化入表達受體菌BL21（DE3）。挑取單克隆，接種于LB/KMN培養基，37℃、250 r/min培養過夜，次日按1∶100的比例加入到新鮮的LB/KMN培養基中，37℃，250 r/min劇烈震蕩培養。分別進行誘導溫度、誘導劑濃度、誘導時間和誘導菌起始生長量對重組蛋白表達量的影響。收集菌液，SDS-PAGE蛋白電泳檢測。同時設空載體，未加IPTG的重組質粒作對照。

收集表達的菌體，超聲波破碎，于4℃，4 000×g離心20 min，分別收集上清和沉淀，取樣進行SDS-PAGE電泳檢測，鑒定重組蛋白表達的形式。

1.2.4 重組表達蛋白的純化與Western blot鑒定 大量表達重組蛋白AjCathI 2-3 L，離心收集菌體。用預冷的裂解緩沖液懸浮菌體，加入適當的蛋白酶抑制劑PMSF。冰浴下超聲破碎菌體至菌液較清無黏性（功率400-480 W，破碎5 s間隔10 s，25 min）。4 000×g離心20 min，收集沉淀，再用10 mL 0.5 mol/L尿素，PBS洗滌液各清洗一次，4 000×g離心20 min取沉淀。沉淀用結合緩沖液充分溶解后，10 000×g離心10 min，取上清用0.45 μm濾膜過濾，濾液經AKTA-purifier 100純化系統，金屬鎳螯合層析柱純化。用25 mL洗脫緩沖液洗脫目標蛋白，流速1 mL/min，檢測波長A280。收集洗脫峰蛋白，取少量SDS-PAGE電泳。

表1 AjCathI克隆和原核表達的引物

取純化后的重組蛋白經SDS-PAGE電泳后，100 mA，轉移1 h，將蛋白印跡至PVDF膜上。1%牛血清白蛋白/TBST封閉液1∶6 000稀釋一抗（His·Tag單抗），4℃孵育過夜。1∶10 000稀釋二抗（山羊抗鼠IgG-AP），室溫孵育1 h。DAB顯色，清水洗凈，觀察結果。

1.2.5 重組表達蛋白的復性 采用透析法，將洗脫緩沖液中的8 mol/L尿素逐步降低至6、4、2和1 mol/L透析重組表達蛋白，最后用PBS溶液透析1次，將目的蛋白溶液中的尿素完全去除。由于蛋白在變性狀態時疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多會形成可見的沉淀析出。復性后的蛋白溶解度增加，但仍然會有一些沒有復性成功的蛋白沉淀，10 000×g離心10 min，收集上清。同時取少量SDS-PAGE電泳檢測復性后的重組蛋白是否發生斷裂。

2 結果

2.1 日本鰻鱺AjCathI基因cDNA的獲得

應用特異性引物5CR1、5CR2和SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit 提供的通用引物，從日本鰻鱺肝組織擴增出一條約300 bp大小的片段，經純化、連接、轉化、質粒提取和陽性克隆鑒定，得到陽性重組子并測序。結果得到一條包含5' UTR和一部分編碼在內的349 bp的片段，與日本鰻鱺AjCathI 3' Race產物比對，兩者有一個223 bp的重疊區，經過序列拼接和堿基校對最終得到842 bp全長的AjCathI cDNA。AjCathI cDNA序列由69 bp 5' UTR、570 bp ORF和203 bp 3' UTR 三部分組成，編碼189個氨基酸（圖1）。經提交GenBank檢索表明，從日本鰻鱺肝臟分離得到的AjCathI基因屬于新的Cathelicidin家族基因，GenBank登錄號為AFP72291。

2.2 日本鰻鱺AjCathI基因與其他動物Cathelicidin基因編碼的氨基酸同源性比對與序列分析

日本鰻鱺AjCathI cDNA推導的氨基酸序列與部分已分離到的或由核苷酸推導出的Cathelicidin序列比對，顯示4個半胱氨酸保守位點高度一致，并且同一屬的魚類，Cathelicidin在信號肽氨基酸的組成上基本一致。AjCathI并不含有Cathelin保守區，與其他動物Cathelicidin氨基酸同源性較低，為25%-53%。參考已報道源于嗜中性粒細胞彈性蛋白酶作用的位點，推測AjCathI成熟肽為50個氨基酸（圖1）。AjCathI抗菌成熟肽與香魚抗菌成熟肽相似性最高，同源性為65.57%。系統進化分析（圖2）表明，AjCathI與魚類親緣關系較近，與大西洋鱘Cathelicidin同源性最高，處在同一個分支上。

2.3 日本鰻鱺AjCathI的原核表達

取單克隆陽性鑒定，測序，結果證明連接正確，核苷酸的開放閱讀框（ORF）編碼連續，并連有6個His標簽，最終獲得正確構建的pET-28a /AjCathI表達載體。將pET-28a /AjCathI重組質粒轉化至BL21（DE3），誘導表達，表達產物經15% SDSPAGE，對凝膠染色、脫色后，重組質粒和空質粒相比，具有明顯的表達蛋白帶，重組質粒表達蛋白分子量在19.0 kD左右，與計算的理論分子量19.575 kD相似（圖3）。

2.4 重組蛋白表達形式的鑒定

取表達菌體超聲波破碎并離心后的上清和沉淀，進行SDS-PAGE電泳結果（圖4）顯示，可見表達產物絕大部分以包涵體形式存在于菌體沉淀中，菌體上清中幾乎沒有可溶狀態的表達產物存在。

圖2 日本鰻鱺AjCathI氨基酸序列與其它已知Cathelicidin氨基酸序列系統進化樹分析

圖3 pET-28a/AjCathI重組質粒在不同誘導時間下的表達結果

圖4 重組表達pET-28a/AjCathI蛋白SDS-PAGE電泳結果

2.5 重組蛋白表達的純化

為了得到AjCathI表達產物，將超聲破碎菌體收集的沉淀部分過鎳離子螯合親和層析柱，用咪唑洗脫螯合的融合蛋白，280 nm檢測紫外吸收曲線，可見到明顯的洗脫蛋白峰（圖5）。收集洗脫部分進行SDS-PAGE電泳（圖6），兩個蛋白洗脫峰中均含有目的蛋白AjCathI。以6-His-tag單克隆抗體做Western blot 鑒定純化產物，結果（圖7）顯示為陽性條帶。

圖5 親和層析柱（IMAC）純化目的蛋白AjCathI

圖6 IMAC洗脫蛋白電泳

圖7 Western blot鑒定AjCathI

圖8 重組蛋白復性分析

2.6 重組蛋白的復性

通過黏度和濁度判斷蛋白復性效果，重組蛋白最終溶解于PBS溶液中，呈現透明狀態，說明復性成功。SDS-PAGE電泳（圖8）顯示均有目的條帶，說明蛋白復性過程中基本沒有發生降解和斷裂。

3 討論

Cathelicidin根據成熟肽二級結構的不同分為以下四大類：第一類是α-螺旋結構（如鼠的CRAMP）［10］；第二類是延伸螺旋結構（如牛的indolicidin）［11］，一般含有大量的脯氨酸（13%-49%）和精氨酸（13%-33%）；第三類是環狀結構（如牛的bactenecin）［12］，這一類分子由于含有一個二硫鍵而形成環狀；第四類是β折疊結構（如豬的protegrin1）［13］，這一類分子通常含有2-3個二硫鍵，這些分類結構有利于抗菌肽與細菌細胞膜結合［14］。抗菌肽預測工具（http：//aps.unmc.edu/ AP/prediction/ prediction_main.php）分析AjCathI成熟肽含有疏水性氨基酸殘基蛋氨酸1個，丙氨酸2個，疏水性比例為10%，電荷為+11。DNAstar軟件分析，結果顯示整個成熟肽形成親水性很強的區域，AjCathI為親水性強陽離子抗菌肽，沒有α螺旋結構，形成延伸和任意卷曲的可能性比較大。Garnier等［15］方法分析，AjCathI形成延伸結構的比例為18%，任意卷曲的比例為82%。Geourjon等［16］方法分析，AjCathI形成延伸結構的比例為16%，任意卷曲的比例為84%。Frishman等［17］方法分析，AjCathI形成任意卷曲的可能性為100%。該抗菌肽與以往的抗菌肽結構有一定的差異，其是否在水溶液中形成任意卷曲結構，而在與生物膜接觸時形成α螺旋結構有待進一步考證，因此抗菌作用機制還有待通過圓二色譜及定位圓二色譜法、固相核磁共振技術、中子衍射和X-光散射等技術進一步研究。

目前，用于原核表達系統的基因工程載體主要分為非融合表達載體和融合表達載體，后者又以攜帶6×His Tag和谷胱甘肽轉移酶標簽（GST Tag）的載體應用最為廣泛。本試驗選用了高效融合表達載體pET-28a，pET-28a為含有T7強啟動子的原核高效表達載體，可將目的序列插入多克隆位點，表達出目的蛋白，同時載體攜帶有6個His標簽，便于后續的純化。在實驗中我們曾經嘗試用pGEX-4T-1表達載體，通過控制培養條件，諸如IPTG濃度、培養溫度和誘導時間等來增加蛋白的表達量，但多次實驗證明了pGEX-4T-1質粒無法表達重組蛋白。

誘導條件對重組蛋白的表達也有不同程度的影響，如IPTG濃度、誘導時間、誘導溫度、大腸桿菌起始濃度、培養基的組成、pH和溶解氧等。王沛珍［18］報道低溫16℃可以增加thanatin抗菌肽表達量和可溶性，同時誘導9 h為最佳誘導時間。Ramos等［19］報道將誘導溫度從37℃降到30℃可以增加滿月蛤（Lucina pectinata）rHbII的表達量。Ma等［20］報道在YT培養基中加入0.5%（w/v）的葡萄糖可以顯著增加adenoregulin抗菌肽的表達量。本實驗發現誘導溫度和誘導時間對Cathelicidin蛋白的表達量有比較顯著的影響。AjCathI在溫度為42℃，誘導時間為7 h蛋白表達量最高。

在原核表達過程中導致包涵體形成的原因有很多［21-23］。本實驗最終得到目的蛋白是以包涵體的形式存在，包涵體存在也有優點，如蛋白質表達量高，可避免宿主細胞蛋白酶對目的蛋白降解，包涵體易從宿主細胞中純化，可避免毒性蛋白（如毒素蛋白）對宿主細胞的毒性等優勢。洗脫目的蛋白的方法有兩種，一種是降低pH洗脫，降低pH值可以減弱組氨酸和鎳離子之間的作用力，從而對蛋白進行洗脫，降低pH值洗脫不會在洗脫的蛋白中帶入高濃度的咪唑，但很可能引起目標蛋白在等電點附近的沉淀。另一種方法是升高咪唑的濃度，競爭目的蛋白與Ni2+結合，從而洗脫蛋白。此方法簡單易行，但同時洗脫的目的蛋白含有高濃度的咪唑。此外，也有用咪唑和降低pH值相結合的方法進行洗脫，Zhang等［24］先用60 mmol/L pH8.0的咪唑洗脫雜蛋白，再用pH4.0的緩沖液洗脫目的蛋白hepcidin。本實驗采用了一步咪唑洗脫方法，最終得到大量的AjCathI蛋白。包涵體復性的方法有很多，如稀釋復性、透析復性、超濾復性、層析柱復性、溫度跳躍式復性等。本實驗采用了透析復性，最終滅菌水溶解凍干的目的蛋白澄清，說明復性成功，SDS-PAGE電泳檢測蛋白完整性很好。

LL-37是人類唯一的Cathelicidin類抗菌肽，具有廣譜的抗菌活性、化學趨化性及促進血管生成和傷口修復性等特點，致使許多學者采用不同的方法體外表達重組蛋白，包括采用GST和pET系列載體及不同的純化方法。馮云等［25］表達了GST-FALL-39（最開始推測的人類Cathelicidin成熟肽，其比LL-37多兩個氨基酸）抗菌肽，GST-FALL-39存在于菌體裂解液的上清中，通過凝膠4B柱及AU-PAGE得到高純度的蛋白。Moon等［26］應用與馮云等相似的方法表達出GST-LL-37融合蛋白，并發現低溫30℃，及低IPTG濃度（0.1 mmol/L）可以顯著增加可溶性重組蛋白的產量。Li等［27］應用pET32a載體也表達出可溶性的LL-37重組蛋白，應用親和色譜和反相色譜去除硫氧還原蛋白及其它雜蛋白，得到含有6個His-tag的LL-37蛋白。魚類Cathelicidin如同哺乳動物一樣只有成熟肽部分具有抗菌活性。一些學者原核表達出Cathelicidin prodomain，再用彈性蛋白酶酶解重組蛋白，確認出成熟肽序列。至今大西洋鱈魚、虹鱒、香魚Cathelicidin成熟肽已得到確認，成熟肽均具有較強的抗菌活性。

4 結論

本研究克隆并表達了日本鰻鱺抗菌肽AjCathI。AjCathI的cDNA全長為 842 bp，編碼 189個氨基酸。將AjCathI基因克隆至pET-28a 載體，pET-28a/ AjCathI蛋白最佳表達條件為42℃，誘導7 h，并以包涵體形式存在。經鎳柱純化、Western blot驗證和透析復性，最終獲得高純度的重組蛋白。

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（責任編輯 馬鑫）

Cloning and Prokaryotic Expression of Cathelicidin Gene from Japanese Eel I，Anguilla japonica

Zhang Dongling1Yu Dahui2
（1. Fisheries College，Jimei University，Engineer Research Center of Eel Modern Industry Technology，Ministry of Education，Xiamen 361021；2. South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Guangzhou 510300）

Cathelicidin， an utmost family of antibacterial peptide so far， possesses multiple biological functions. In order to explore and exploit the antibacterial mechanism and potential biological functions of Cathelicidin， full-length sequence of cDNA of Cathelicidin gene from Japanese eel Anguilla japonica I（AjCathI）was obtained by RACE-PCR. The full cDNA of AjCathI was 842 bp and the ORF contained 570 bp encoding 189 amino acids. Analysis of amino acid sequence demonstrated that AjCathI contained 4 conservative cysteine residues at C terminal，and the mature antibacterial peptide had the highest similarity with Plecoglossus altivelis by homology of 65.57%. Phylogenetic analysis revealed that AjCathI shared a common evolutionary origin with other teleost fishes. AjCathI was cloned into pET-28a and expressed in Escherichia coli BL21（DE3）. The result manifested that AjCathI protein was expressed in inclusion bodies. The protein was isolated by Ni column， identified by Western blot and re-natured by dialysis， the protein of high purity was gained. This study laid the foundation for further verifying mature peptide sequence of AjCathI and studying its antibacterial activities as well as other biological functions.

Anguilla japonica；Cathelicidin；antibacterial peptide；RACE-PCR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.018

2014-10-22

福建省教育廳重點項目（JA13171），集美大學李尚大學科建設基金項目（ZC2013003），集美大學鰻鱺現代產業技術教育部工程研究中心開放基金項目（ZK2013005）

張東玲，女，博士，講師，研究方向：水產動物免疫學；E-mail：donglingzhang@126.com

喻達輝，博士，研究員，研究方向：水產生物技術與遺傳育種；E-mail：pearlydh@163.com