小桐子肌醇半乳糖苷合成酶3的基因克隆及其生物信息學分析和功能初步驗證

王海波鄒竹榮龔明

（1.云南師范大學生命科學學院 生物能源持續開發利用教育部工程研究中心 云南省生物質能與環境生物技術重點實驗室，昆明 650500；2.曲靖師范學院生物資源與環境科學學院，曲靖 655011）

小桐子肌醇半乳糖苷合成酶3的基因克隆及其生物信息學分析和功能初步驗證

王海波1，2鄒竹榮1龔明1

（1.云南師范大學生命科學學院 生物能源持續開發利用教育部工程研究中心 云南省生物質能與環境生物技術重點實驗室，昆明 650500；2.曲靖師范學院生物資源與環境科學學院，曲靖 655011）

旨在研究可溶性糖在小桐子抗冷性形成中的作用機制及其相關抗冷基因工程的應用。克隆了小桐子肌醇半乳糖苷合成酶家族成員3基因（JcGS3）的全長cDNA，序列長1 053 bp，包含完整的開放閱讀框1 008 bp，編碼由335個氨基酸組成的酶蛋白（理論分子量為38 kD、等電點為5.44，含有典型的DxD基序）。對其相應基因組序列中啟動子區域進行分析，鑒定到了TATA框、CAAT框、CRT/DRE低溫響應元件以及ABA應答元件等。進一步將其在酵母中表達，發現該基因的表達能夠顯著提高其重組酵母菌的低溫抵抗能力。

小桐子；肌醇半乳糖苷合成酶3；cDNA克隆；生物信息學分析；酵母表達

小桐子（Jatropha curcas L.）屬大戟科麻瘋樹屬能源植物［1，2］，原產美洲，現廣泛分布于全球的熱帶地區，在中國主要集中在四川、云南、廣西、海南、福建等省區［3］。小桐子種子油含量高達40%-60%，流動性好，品質優良，是理想的柴油替代品［4，5］。同時，小桐子還是干熱河谷地區保水固土、防止沙化、增加有機質、構建防護林的優良樹種［6］，極具開發與利用價值。

在植物中，棉子糖系列寡糖（Raffinose family oligosaccharides，RFO）是由不同數量的半乳糖基通過α-1，6-糖苷鍵連接到蔗糖中葡萄糖基的6位羥基上形成的，根據連接半乳糖基的數量不同，主要包括：棉子糖（含1個半乳糖基）、水蘇糖（含2個半乳糖基）和毛蕊花糖（含3個半乳糖基）。近年來的研究表明棉子糖系列寡糖的代謝在植物生長發育、逆境脅迫反應中發揮重要作用，尤其在種子成熟脫水過程中可以維持多種蛋白質的穩定性，更為重要的是寡糖可以促進種子細胞的玻璃化、避免脫水對細胞的傷害［7］。同時，棉子糖系列寡糖在植物冷馴化中也起到重要作用，很多研究已經證實低溫導致植物葉片和種子中淀粉含量下降，而蔗糖和棉子糖系列寡糖含量升高。棉子糖系列寡糖的積累，特別是位于葉綠體外的寡糖，其通過儲存碳源、滲透調節以及為植物提供低溫保護劑等功能，對于植物抵抗低溫環境有著重要幫助［8］。在棉子糖系列寡糖合成途徑中，肌醇半乳糖苷（Galaetinol）是目前所知的唯一的半乳糖基供體，肌醇半乳糖苷合成酶（Galaetinol synthase，GS，EC 2.4.l.123）催化肌醇半乳糖苷的合成，被認為是棉子糖系列寡糖合成的關鍵酶，其催化反應是寡糖積累的限速步驟。我們先前通過RNA-Seq技術獲得了小桐子低溫鍛煉下的轉錄組和數字基因表達譜數據，從中篩選到在低溫鍛煉過程中差異表達變化非常顯著的小桐子肌醇半乳糖苷合成酶3基因［9，10］。在此基礎上，本研究進一步克隆其全長cDNA序列，并對其進行比較完整的生物信息學分析和轉基因酵母的抗冷性功能初步驗證，以期為研究可溶性糖在小桐子抗冷性形成中的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料及處理 供試小桐子種子取自云南省楚雄州元謀縣。選取飽滿的小桐子種子，用1.5% CuSO4消毒20 min，無菌水漂洗5次，于26℃的恒溫培養箱中吸漲24 h［11］。將吸漲的種子在無菌水中漂洗3次，播于墊有5層用無菌水濕潤濾紙的白磁盤中，于相對濕度（RH）75%、26/20℃、16/8 h光周期的恒溫培養箱中萌發5 d。將發芽的種子播于消毒的培養土中，并于同樣設置條件下的恒溫培養箱中生長15 d至第2片真葉展開，每天用無菌水潤濕培養土。將生長15 d的小桐子幼苗置于相對濕度（RH）75%、12℃、16/8 h光周期的低溫培養箱中進行低溫鍛煉處理，分別取低溫鍛煉12、24和48 h與對照（正常培養）的第2片真葉，用鋁箔紙包好，液氮速凍后保存于-80℃冰箱中用于RNA的提取。

1.1.2 菌株與主要試劑 大腸桿菌Trans1-T1（DH-5α）、BL21（DE3）及酵母菌INVSc1菌株由本實驗室保存；TransZol Up、DNase I、TransStart Taq DNA Polymerase、氨芐青霉素（Amp）、X-gal、IPTG、2× Easy Taq PCR SuperMix（+dye）、TransScript Two-Step RT-PCR SuperMix、EasyPure Quick Gel Extraction Kit、EasyPure Plasmid MiniPrep Kit、pEASY-T1 Cloning Kit、pEASY-E1 Expression Kit、Trans 2K Plus II DNA Marker購自北京全式金生物技術有限公司；BamH I、Xho I限制性內切酶購自大連寶生物公司；引物合成和測序由深圳華大基因有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 利用TransZol Up試劑提取小桐子12℃低溫鍛煉24 h葉片的總RNA，并利用DNase I消化RNA中的基因組DNA，得到純化的總RNA。以Anchored Oligo（dT）18為逆轉錄引物，利用TransScript Two-Step RT-PCR SuperMix合成第一鏈cDNA。

1.2.2 小桐子JcGS3基因全長cDNA的克隆 我們先前獲得了小桐子低溫鍛煉轉錄組和數字基因表達譜數據，從中發現低溫下差異表達變化非常顯著的小桐子肌醇半乳糖苷合成酶3基因（CL2440.Contig2_ JC-CK_1A）［9］。該基因序列長1 463 bp，包含完整ORF編碼框（1 008 bp）。以此序列為基礎設計全長擴增引物（上游F：5'-TTCTTCTTTCCAAACTCG-3'；下游R：5'-TATAATCCACAACCACAT-3'），并送深圳華大基因公司合成。

以1.2.1反轉錄的cDNA為模板，使用熱啟動雙封閉DNA聚合酶TransStart Taq DNA Polymerase進行PCR擴增，擴增條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，50.7℃ 30 s，72℃ 1.5 min，35個循環；72℃ 10 min。擴增完成后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，利用EasyPure Quick Gel Extraction Kit從瓊脂糖凝膠回收目的基因條帶（1 053 bp）。將目的基因片段與克隆載體pEASY-T1連接，轉化大腸桿菌Trans1-T1感受態細胞，涂LB抗性平板（LB+Amp+IPTG+X-gal），過夜生長，進行藍白斑篩選。挑取白斑克隆，進行菌落PCR驗證，重組質粒命名為pEASY-T1-JcGS3，送深圳華大基因公司利用pEASY-T1質粒上的M13F與M13R通用引物進行雙向測序。

1.2.3 小桐子JcGS3基因的生物信息學分析 對于小桐子JcGS3基因的推導蛋白，利用在線工具ProtParam計算蛋白質的理論分子量、等電點等基本參數；利用WolfSport在線軟件對蛋白質亞細胞定位進行預測；利用SignalP 3.0 Server分析蛋白質信號肽序列；利用在線工具TMHMM與Proscale檢測其跨膜結構與親水/疏水特性；利用NCBI CDD工具進行結構域與功能元件的鑒定；利用Swiss-Model與Phyre2進行蛋白質三維結構的同源建模，利用VMD軟件顯示其三維空間結構，并結合Ramachandram圖驗證其準確性。從NCBI下載其它物種的GS氨基酸序列，利用ClustalX進行序列相似性比對，然后用MEGA4.0軟件通過鄰接法構建系統進化樹，并采用泊松法進行檢驗。利用Spidey軟件將克隆的JcGS3 cDNA序列與其對應基因組序列（小桐子基因組數據庫http：//www.kazusa.or.jp/jatropha/）進行比對以確定基因內含子與外顯子的結構，同時利用在線軟件PlantCARE與PLACE進行啟動子順式作用元件的分析。

1.2.4 小桐子JcGS3基因酵母表達載體的構建、轉化及功能驗證 利用BamH I與Xho I雙酶切質粒pEASY-T1-JcGS3與酵母表達載體pYES2，切膠回收JcGS3片段與pYES2的酶切大片段，T4 DNA連接酶22℃連接5 h，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂LB+Amp平板，過夜生長，經菌落PCR驗證的陽性克隆命名為pYES2-JcGS3。提取重組酵母表達質粒pYES2-JcGS3，轉化釀酒酵母野生型菌株INVSc1，命名為INVSc1-pYES2-JcGS3；同時將對照空載體pYES2質粒也轉化INVSc1，命名為INVSc1-pYES2；通過酵母菌落PCR驗證以確定陽性克隆。

分別挑取重組酵母INVSc1-pYES2-JcGS3及對照INVSc1-pYES2單菌落，接種于15 mL YPD培養基中，30℃振蕩過夜培養。用YPD培養基調至OD600=0.4-0.6，取20 mL菌液于8 000 r/min離心1 min，棄上清，用20 mL YPG誘導培養基重懸菌體，30℃誘導表達24-36 h至OD600＞2.0。取誘導表達菌液2 mL至60 mL YPG誘導培養基中，調菌液OD600=0.2，在正常30℃條件下或18℃低溫條件下繼續振蕩培養，每3 h間隔取樣，測定樣品的OD600值。以時間為橫坐標，OD600為縱坐標，繪制酵母菌的生長曲線，比較重組酵母菌與對照酵母菌在正常和低溫條件下的生長差異。

2 結果

2.1 小桐子JcGS3基因全長cDNA的克隆

以小桐子12℃低溫鍛煉24 h的葉片材料提取總RNA，并反轉錄成cDNA為模板，利用JcGS3上下游引物擴增JcGS3基因的全長cDNA。結果表明，擴增產物約1.1 kb，與預期大小一致（圖1-A）。將目的條帶切膠回收后與T/A克隆載體pEASY-T1連接、轉化大腸桿菌，并經菌落PCR鑒定（圖1-B），陽性克隆命名為pEASY-T1-JcGS3，接菌提取其質粒DNA（圖1-C）。

2.2 小桐子JcGS3基因的生物信息學分析

經過測序，克隆的JcGS3基因cDNA序列全長為1 053 bp，已提交至NCBI GenBank（登錄號KJ670151.1）。利用NCBI ORFfinder分析表明其包含完整的開放閱讀框（ORF）1 008 bp，編碼一個由335個氨基酸（aa）組成的蛋白（圖2），其理論分子量推測為38 kD、等電點為5.44。SOPM服務器分析該蛋白的二級結構，α-螺旋109 aa，占32.54%；β-折疊76 aa，占22.69%；β-轉角33 aa，占9.85%；無規則卷曲117 aa，占34.93%。預測分析該蛋白質沒有信號肽、疏水區域及跨膜區的存在，說明該蛋白質屬于可溶性胞質蛋白，這與PSORT預測該蛋白質主要定位在細胞質中相一致。

利用克隆得到的JcGS3 cDNA序列，對小桐子基因組數據庫（http：//www.kazusa.or.jp/jatropha/）進行在線Blast檢索，得到其對應的基因組序列，發現JcGS3基因包含4個外顯子與3個內含子。同時，也獲取了該基因ORF上游1 000 bp的啟動子序列，利用在線軟件PlantCARE與PLACE對其進行了順式作用元件分析發現，啟動子區域轉錄因子結合位點較多，調控特性也很復雜（圖3）。具備多個TATA-box，TATA-box是RNA聚合酶II結合位點，保證轉錄的精確起始，并調控上游激活蛋白的作用；同時，其上游還包含多個CAAT-box，CAAT-box主要控制轉錄起始的頻率并增強轉錄活性。以上兩個順式作用元件是啟動子、增強子區域常見的作用元件，小桐子JcGS3基因均具有。另外，還鑒定到植物特有的CRT/DRE冷響應元件（CCGAC），以及脫落酸（ABA）應答元件，如ABRE（PyCGTGGC）、MYB（PyAACT/GC）和MYC（CANNTG）。除此以外，還鑒定出的元件，包括ASF、CCAAT-box、GATA-box、W-box等順式作用元件。以上充分說明小桐子JcGS3基因是受多重信號系統的調節。

圖1 小桐子JcGS3基因的cDNA克隆

圖2 小桐子JcGS3 cDNA與推導的氨基酸序列

圖3 小桐子JcGS3基因啟動子的順式作用元件

通過與NCBI中不同植物GS氨基酸序列進行比對分析（圖4-A）發現，GS氨基酸序列在N端和C端變化差異較大，而中間部位與C末端（PSAA）的氨基酸殘基則較為保守。小桐子GS3中存在一個DxD基序（DGD，Asp121-Gly122-Asp123位），該基序是此類蛋白質的共同基序，也是Ca2+、Mn2+的結合位點（Asp121、Asp123、His258）。在N端還發現一個β-α-β超二級結構（圖4中用M標識），這也是該類蛋白催化所必須的。進一步通過CDD工具進行保守結構域預測分析（圖4-B）發現，JcGS3酶蛋白包含RfaJ結構域，該結構域具有脂多糖的合成活性及葡萄糖基轉移酶活性，同時還鑒定到GAT結構域。小桐子JcGS3屬于GT8糖基轉移酶家族，該家族中除了轉移葡萄糖殘基外，還可以轉移半乳糖殘基，另外具有糖鏈分支的能力，負責形成脂多糖、寡聚糖等。通過CDD比對已經測定結構的GS3蛋白，推測小桐子GS3蛋白的催化活性中心由19個氨基酸殘基組成（圖4中用*號標注），與文獻報道的一致。

為了進一步闡明植物GS的進化關系，通過ClustalW軟件對不同植物GS氨基酸序列進行了更廣泛的多重比對分析，并使用MEGA軟件以鄰接法構建了其系統進化樹（圖5）。生成的進化樹分成兩大主要分支：在分支I中，單子葉植物與雙子葉植物都有；而在分支II中，全部是雙子葉植物，小桐子JcGS3蛋白也歸為II類。部分物種GS家族中的不同成員出現在不同大分支中，如：擬南芥在兩種類型中基本數量一致，而與小桐子在進化上較近的毛果楊，有很大一部分分布于I類型中。這些結果說明植物GS在進化過程中不是平行漸進分化的，而是表現出不同程度的跳躍進化。

根據已經測定的人類GS蛋白的晶體結構進行小桐子GS3蛋白質三維結構的同源建模，發現該蛋白質不僅在一級氨基酸序列非常保守，而且在空間結構上更加保守：核心7條基本平行的β-折疊構成一個保守結構域，周圍則由5段進化上不太保守但不可或缺的α-螺旋圍繞形成（圖6-A）。在β-折疊片層的中間凹陷部位被認為是該酶的催化中心部位，也是結合半乳糖與蔗糖的活性中心。

Ramachandran plots 是反映立體化學質量（Stereochemical quality）的參數。通過分析φ角和ψ角的分布方式對模擬的三維結構是否與自然結構趨勢相同進行評估，藍線區域是最理想的φ 角和ψ角分布區域，而藍線區域外部則為不合理區域。如果預測的蛋白質殘基的二面角有90%以上位于藍線區域，則表明其有穩定的空間結構。圖6-B顯示，構建的小桐子GS3 蛋白三維結構的φ角和ψ角有95.8%位于Ramachandran 圖中能量穩定區域，表明該結構是可靠的。

2.3 通過酵母表達初步驗證小桐子JcGS3的功能

將小桐子JcGS3基因通過BamH I與Xho I雙酶切克隆到酵母表達質粒pYES2中，獲得其重組酵母表達載體pYES2-JcGS3（圖7）。隨后將其轉化酵母菌INVSc1，利用JcGS3上下游引物進行酵母菌落PCR鑒定，結果（圖8）表明該重組酵母表達質粒已經成功轉化酵母。

通過比較重組酵母菌INVSc1-pYES2-JcGS3與對照酵母菌INVSc1-pYES2的生長曲線（圖9）發現，在無脅迫條件下，兩者的生長速率基本相似，且幾乎不存在停滯期而直接進入對數生長期，在27 h時基本進入穩定平臺期，這表明正常條件下JcGS3基因的表達對酵母菌生長幾乎沒有影響（圖9-A）。在18℃低溫脅迫條件下，JcGS3重組酵母菌與對照酵母菌剛開始都出現了約3 h的生長停滯期，之后逐漸進入對數生長期；與對照相比，JcGS3重組酵母菌在生長的前6 h生長速率基本相同，之后到進入平臺期的24 h內，JcGS3重組酵母菌的生長速率明顯快于對照（圖9-B）。另外，JcGS3重組酵母菌在進入平臺期后，對照酵母菌雖受低溫脅迫，但仍保持生長的趨勢，進入平臺期的時間要稍晚3-6 h。該結果清楚表明JcGS3基因在酵母中過量表達能夠顯著增強酵母菌的低溫抵抗能力，與抗冷性直接相關。

3 討論

圖4 小桐子JcGS3推導氨基酸序列與其它植物GS的多重序列比對（A）及其CDD預測（B）

圖5 通過ClustalW序列比對和MEGA4.0鄰接法構建的植物GS3進化樹

植物在低溫脅迫下，碳素同化總量下降，但可溶性糖增加，這樣可以降低植物細胞的滲透勢以抵抗逆境［12，13］。此過程不僅在于可溶性糖參與細胞的滲透調節作用，更重要的原因可能在于許多可溶性糖是植物適應環境的信號物質［14］。淀粉分解與棉子糖系列寡糖合成代謝是諸多可溶性糖積累的樞紐。在擬南芥中，Kaplan等［15］通過代謝動力學研究表明，低溫脅迫下第一個含量直接增加的碳水化合物是由淀粉經β-淀粉酶水解而來的麥芽糖和麥芽三糖，緊接著是6-磷酸葡萄糖和6-磷酸果糖，接下來是蔗糖、以及葡萄糖和果糖。另外，肌醇半乳糖、海藻糖、棉子糖以及水蘇糖等低聚糖在之后的滲透調節中起更重要的作用［12］。而作為棉子糖系列寡糖合成中半乳糖基供體的肌醇半乳糖苷是此類低聚糖合成的關鍵底物，催化它生成的肌醇半乳糖苷合成酶（GS）已被認為是此代謝途徑的限速關鍵酶。已報道的GS為分子量在36-38 kD的單體蛋白，活性最適pH為7-8，且活性可進一步被DDT（二硫蘇糖醇）和低濃度的MnCl2增強。GS對其底物UDP-半乳糖和肌醇的米氏常數分別為0.16-1.8 mmol/L和4.0-6.5 mmol/L，對UDP-半乳糖和肌醇具有很強的專一性，而對ADP-Gal、GDP-Gal等糖類或肌醇的差向異構體均無作用［16］。

圖6 同源建模得到的小桐子JcGS3蛋白三維空間結構

圖7 pYES2-JcGS3重組質粒的構建

圖8 轉pYES2-JcGS3重組酵母INVSc1的菌落PCR驗證

肌醇半乳糖苷合成酶屬于多基因家族，已經報道在擬南芥［17］、紫花苜蓿［18］、番茄［19］、玉米［20］等植物中克隆到GS基因40多個。目前，在擬南芥中發現了10個編碼GS的基因，其中有3個基因產物只存在于成熟后的種子中，AtGS1與AtGS2受干旱和高鹽脅迫的誘導，但對低溫沒有響應，而AtGS3只在低溫條件下被誘導表達［17］。玉米基因組分析表明它含有3個GS基因，主要在種子成熟組織中表達［20］。低溫脅迫下，匍匐筋骨草的葉肉細胞和韌皮部細胞中GS1與GS2表達上調，很大程度上提高了其抗冷性［21］。Cunningham等［18］從紫花苜蓿（Medicago sativa）宿根中克隆得到一條長度為1 326 bp的GS全長cDNA，編碼325個氨基酸。實驗表明，未經低溫處理的紫花苜蓿宿根中沒有GS基因表達，而將植株轉移至低溫環境則開始轉錄，并且在2℃下持續2 d后達到最大表達量，轉移至常溫后，轉錄量再次減少直至消失。我們最近通過數字基因表達譜分析發現，小桐子肌醇半乳糖苷合成酶3基因（CL2440.Contig2_JC-CK_1A）在12℃低溫鍛煉12 h后表達上調近467.88倍［9］，本研究中該基因JcGS3在酵母中過量表達能顯著增強重組酵母菌的低溫抵抗能力，推測該酶能在酵母中催化合成一系列起滲透調節作用的低聚糖類物質從而提高酵母的抗冷性。這些研究事實充分表明，GS與植物抗冷性密切相關。但是，植物GS作為一個大家族，只有部分GS基因的表達直接參與植物抗冷性形成，很多與之相關的抗逆性存在交叉性，即不同的GS基因可以被不同的逆境條件所誘導，同一逆境又可以同時誘導多種GS基因的表達，所以對于小桐子JcGS3基因進行交叉抗逆性及差異表達特性研究進而獲得轉基因小桐子株系是未來的研究方向。

圖9 重組酵母菌INVSc1-pYES2-JcGS3與對照酵母菌INVSc1-pYES2在無脅迫（A）與18℃低溫脅迫（B）條件下的生長曲線

4 結論

本研究基于我們獲得的小桐子低溫鍛煉下的轉錄組和數字基因表達譜數據，篩選到低溫下差異表達變化較顯著的小桐子肌醇半乳糖苷合成酶3基因JcGS3，并利用RT-PCR技術成功克隆到該基因。序列分析表明，其包含1 008 bp的開放閱讀框，編碼335個氨基酸，理論分子量為38 kD，等電點為5.44。生物信息學預測顯示，該蛋白質沒有信號肽、疏水區域及跨膜區的存在，主要定位在細胞質中；啟動子序列中鑒定到了多個TATA框、CAAT框、CRT/ DRE冷響應元件、脫落酸（ABA）應答元件；包含GT8糖基轉移酶家族的典型RfaJ與GAT結構域。將JcGS3基因構建了酵母表達載體，發現該基因的表達能夠顯著提高其重組酵母菌的低溫抵抗能力。

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（責任編輯 馬鑫）

Gene Cloning，Bioinformatic Analysis and Preliminary Functional Characterization of Gene Encoding Galactinol Synthase 3 in Jatropha curcas

Wang Haibo1，2Zou Zhurong1Gong Ming1
（1. School of Life Sciences of Yunnan Normal University，Engineering Research Center of Sustainable Development and Utilization of Biomass Energy of Ministry of Education，Key Laboratory of Biomass Energy and Environmental Biotechnology of Yunnan Province，Kunming 650500；2. College of Biological Resource and Environmental Science，Qujing Normal University，Qujing 655011）

It was to study the roles of soluble sugars in the cold-tolerance of Jatropha curcas and their related applications in genetic engineering. The full length cDNA of J. curcas， a gene member of such enzyme family（JcGS3）was cloned herein， with a size of 1 053 bp covering the entire open reading frame（ORF）of 1 008 bp. This ORF encoded a polypeptide of 335 amino acids， with theoretical molecular weight of 38 kD， pI value of 5.44， and the typical DxD motif. Further promoter analysis of the genomic sequence of JcGS3 indicated the occurrence of TATA-box， CAAT-box， cold responsive elements of CRT/DRE， and ABA responsive elements. In addition， JcGS3 was characterized with a significant effect on improving the cold-tolerance of the recombinant yeast strain.

Jatropha curcas；galactinol synthase 3；cDNA cloning；bioinformatic analysis；yeast expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.014

2014-11-05

國家自然科學基金項目（31260064，31460059，31460179），云南省教育廳科研基金重大專項項目（ZD2010004）

王海波，男，博士研究生，研究方向：植物逆境生物學；E-mail：bocai0406@163.com

龔明，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：植物逆境生物學；E-mail：gongming63@163.com