擬南芥AMP1負調控植物對高鹽脅迫的反應

夏金嬋何金環

（1.河南中醫學院，鄭州 450008；2.河南牧業經濟學院，鄭州 450008）

擬南芥AMP1負調控植物對高鹽脅迫的反應

夏金嬋1何金環2

（1.河南中醫學院，鄭州 450008；2.河南牧業經濟學院，鄭州 450008）

高鹽脅迫嚴重影響植物的生長發育及農作物產量，因此鑒定鹽脅迫響應相關基因至關重要。擬南芥的AMP1編碼一個推測的谷氨酸羧肽酶，參與植物的生長發育、光形態建成與種子休眠。研究證明了AMP1的一個新功能，它的缺失提高了缺失突變體amp1的抗高鹽脅迫的能力，研究證明amp1突變體的強抗高鹽脅迫表型一方面是由于在高鹽脅迫下amp1突變體比野生型中積累了更多的甜菜堿和脯氨酸降低了突變體細胞的水勢，另一方面高鹽脅迫條件下amp1突變體中高鹽脅迫響應的下游基因RD29A，以及AHA3的表達量也高于野生型，后者可促進Na+的外排；高鹽條件能夠對植物造成氧化脅迫，研究發現AMP1的缺失還上調了抗氧化相關基因ZAT10/12的表達量，進而降低了在高鹽脅迫條件下amp1突變體內過氧化物的積累水平，減輕對細胞的損傷和生長的抑制，這些都提高了amp1突變體的抗高鹽脅迫的能力。以上結果證明在擬南芥中AMP1負調控植物對高鹽脅迫的反應過程。

AMP1；高鹽脅迫；ZAT10/12；RD29A

目前，土壤的鹽堿化是農業生產面臨的一個嚴重問題，限制著全球農作物的產量，其中20%的灌溉區域和30%的干旱區域都受到土壤鹽堿化的威脅［1］。有些植物在適應鹽生環境時形成了對Na+的外排和區隔化的調節機理，使細胞質內保持較低的Na+濃度以適應鹽生環境對植物生長和發育的影響，土壤中Na+過多會引起植物體內離子不平衡、水分虧缺和離子毒害，并且由于不恰當的灌溉和污水的任意排放鹽堿化面積還在不斷擴大，臨海的耕種土地由于暴雨和風的影響鹽堿化的速度更快，因此，剖析植物對高鹽的應答機制、提高其抗鹽能力在農業生產上有重要的理論和現實意義。植物的抗鹽反應受許多基因的調控，是一個復雜的過程，盡管在過去10年間，通過各種篩選和克隆的方法已得到一系列與鹽脅迫信號途徑相關的基因，例如：SOS、HKT1或NHX1基因等，其中鹽過度敏感（Salt overly sensitive，SOS）途徑的重要生理功能是在鹽脅迫下進行離子穩態調節和提高耐鹽性［2，3］，但是仍需要鑒定新的鹽脅迫反應基因，以期通過分子生物學手段提高農作物的抗鹽能力。

擬南芥的AMP1（Altered meristem program）基因編碼一個谷氨酸羧肽酶，定位在內質網膜上，參與一些信號分子的形成過程，AMP1對莖頂端分生組織的生長發育和調控植物激素的穩態方面有重要的作用，還可調節植物體內NO的含量，參與植物的抗旱反應過程［4-6］。敲除AMP1基因可使突變體中細胞分裂素的含量增加，導致CYCD3；1（cyclin D3）的表達量增加［7-9］，但是，在野生型擬南芥中外施細胞分裂素或者過表達CYCD3；1都不能夠模擬amp1突變體的表型，這暗示在amp1突變體中不僅僅是細胞分裂素的含量增加和CYCD3；1的表達量增加，或許是谷氨酸羧肽酶的缺失影響了植物體中一些小的信號分子，它們影響了植物的生長發育［3］。本研究利用擬南芥AMP1基因的缺失突變體，通過對該突變體amp1進行NaCl脅迫，觀察植株的表型變化，進而檢測其體內可溶性糖與脯氨酸含量、鹽脅迫下游基因RD29A的表達量，以及離子含量等，探討擬南芥AMP1基因在抗鹽脅迫方面的生物學作用，旨在為利用生物工程手段提高植物的耐鹽性提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗中所用的野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana）和amp1突變體均為Col-0生態型背景。amp1突變體是由Abed Chaudhury博士（Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization，Plant Industry，Canberra，Australia）贈送。

1.2 方法

1.2.1 培養方法 在營養土中培養擬南芥的過程為：將4℃同步化處理2-3 d后的種子均勻地播種于營養土上，澆上水后移至正常光照下培養。培養皿中無菌培養擬南芥的過程為：要先對種子進行表面消毒，4℃同步化處理2-3 d后，均勻地種在含有0.8%（W/V）瓊脂（Sigma）的1/2MS（Murashige and Skoog salts，Sigma M5519）的培養基上，放在培養間中培養。如果是NaCl處理時，把所需量的NaCl加在1/2 MS培養基上，滅菌，制成NaCl培養基，野生型和突變體在正常培養基上生長1周，再移到不同濃度的NaCl培養基上，觀察表型。培養間的培養條件：溫度為22℃，光照強度為100 μmol· m-2·s-1，光周期為16 h光照/8 h黑暗交替。

1.2.2 生理指標的測定 兩周大的生長在正常培養基上野生型擬南芥和amp1 突變體的幼苗，移到含有100 mmol/L NaCl 的培養基上處理12 h，測定野生型擬南芥和amp1 突變體在NaCl 處理下可溶性糖和脯氨酸的含量?？扇苄蕴呛繙y定，稱取800 mg擬南芥放于大試管，加20 mL蒸餾水，沸水浴20 min，冷卻后過濾至100 ml容量瓶，再加2 mL 5%硫酸鋅溶液，2 mL 0.3N Ba（OH）2溶液定容至100 mL。取1 mL提取液加1 mL蒸餾水，加0.5 mL蒽酮-乙酸乙酯，再加5 mL濃H2SO4，沸水10 min后，測定620 nm處的吸光值［10］。脯氨酸含量測定，稱取擬南芥約0.15g，加 5 mL 3%磺基水楊酸研磨，再轉移至試管中沸水浴浸提10 min，冷至室溫。取2 mL提取液，加2 mL 冰乙酸，2 mL 2.5%酸性茚三酮，沸水浴顯色 60 min，冷卻至室溫后加4 mL 甲苯，振蕩萃取。取甲苯層測OD520，以甲苯做空白對照［11］。植 株TBARS（Thiobarbituric acd-reactive substances）含量的測定按照描述［12，13］。離子含量的測定是用在1/2MS培養基上生長10 d的野生型和突變體材料，移到含有NaCl的培養基上處理，在指定時間取材，在60℃的烘箱里處理1周使材料干燥。干燥的材料用HNO3消化。再用MS-ICP（Agilent 7500C）測定材料中K+和Na+的含量［14］。

1.2.3 實時熒光定量 PCR 對在培養基上生長1周的野生型和amp1突變體材料轉移到含有NaCl的培養基上進行鹽處理，在相應的時間取材。利用TRIZOL試劑（Sigma，USA）提取總的RNA，用AMV 反轉錄酶（TaKaLa，Dalian）合成第一條cDNA。利用 Agilent Strata-gene 熒光定量 PCR 儀Mx3005P（美國）進行實時熒光定量 PCR 實驗，熒光染料試劑盒采用 SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa，日本），以稀釋10倍的植物cNDA為模板。每20 μL PCR 反應體系中含 1×SYBR PremixEx Taq，上下游引物各 0.2 μmol/L，以及 2 μL 稀釋的cDNA。實驗重復3次。使用 UBQ10（polyubiquitin 10）作為內參對目標基因進行相對定量。

2 結果

2.1 amp1突變體具有強的抗高鹽脅迫能力

為了驗證AMP1基因在抗鹽反應中作用，在1/2 MS培養基中加入不同濃度的NaCl，把野生型和amp1突變體種在含有NaCl的培養基上，發現兩者的萌發率并沒有明顯的區別，但是當我們把在1/2 MS培養基上生長1周的野生型和amp1突變體幼苗移到添加有不同濃度NaCl的培養基上后，生長1周后發現野生型根生長受到的抑制程度遠比突變體的高。我們在處理后的第7天測量了野生型和突變體的根長，并計算了它們的相對根長（相對根長是處理條件下的根長與在正常培養基上生長1周的根長的比值），發現在正常生長條件下，野生型的根比突變體的長，但是在NaCl的處理下，野生型根生長受到明顯的抑制，而突變體的根生長受到的抑制并不明顯。例如，在50 mmol/L NaCl處理下，野生型的根被抑制29.6%，而突變體的根只被抑制13.6%（圖1）。另外，我們把含有自身啟動子的AMP1基因轉入amp1突變體，該突變體即恢復為野生型的表型，這表明amp1突變體的抗鹽能力是由于AMP1基因缺失導致的。

圖1 amp1突變體在NaCl處理下的表型（A）、根長（B）及相對根長（C）

2.2 高鹽脅迫下amp1突變體含有高濃度的可溶性糖和游離脯氨酸

高鹽環境可以對植物造成滲透脅迫，因此，測定植物體在脅迫條件下可溶性糖和脯氨酸的含量，在一定程度上可以判斷植物對高鹽脅迫的抵抗能力［15，16］。圖2顯示，正常生長條件下amp1突變體中可溶性糖含量與野生型中的區別并不明顯，NaCl處理后amp1突變體和野生型中可溶性糖含量均有所提高，但此時突變體中可溶性糖的含量是野生型的 1.28倍，脯氨酸的含量在正常生長條件下amp1突變體中與野生型中區別并不明顯，NaCl處理后amp1突變體和野生型中脯氨酸含量都有所提高，但此時突變體中的脯氨酸是野生型的 1.16倍，因此，在高鹽脅迫條件下amp1突變體中可溶性糖和脯氨酸都高于野生型。鹽脅迫條件下，amp1突變體中可溶性糖和脯氨酸的快速積累可能與可溶性糖和脯氨酸積累相關基因的表達更活躍有關?；诳扇苄蕴呛透彼嵩谥参锏挚果}脅迫中的特殊作用，amp1突變體中高含量的可溶性糖和脯氨酸是突變體抗高鹽脅迫的一個原因。

圖2 野生型擬南芥和amp1突變體在NaCl處理下可溶性糖（A）和脯氨酸（B）的含量

2.3 AMP1基因負調控RD29A 和AHA3的表達

為了進一步探討amp1突變體抗鹽的分子機制，選擇了一個鹽脅迫反應的下游基因RD29A和一個質膜ATP酶［17］，對它們的表達量進行分析（圖3）。用實時熒光定量PCR檢測表明RD29A的表達量在突變體和野生型中都受高鹽脅迫的誘導，但是在突變體中的誘導表達量和時間都明顯比野生型的高和早。例如，在高鹽處理6 h時，RD29A的表達量在野生型中增至1.3倍，在amp1突變體中增至1.6倍；在高鹽處理12 h時，RD29A的表達量在amp1突變體中增至2.3倍，而在野生型中只增至1.5倍。這些結果表明AMP1基因負調控RD29A的表達，導致amp1突變體的強抗鹽能力。AHA3是一個質膜ATP酶，定位在質膜上，高鹽誘導其表達量的升高，參與Na+的外排過程［18］。我們發現AHA3的表達量在突變體和野生型中都受高鹽脅迫的誘導，但是在突變體中的誘導表達量和時間都明顯比野生型的高和早。例如，在高鹽處理6 h時，AHA3的表達量在野生型中增至1.5倍，在amp1突變體中增至1.8倍；在高鹽處理12 h時，AHA3的表達量在amp1突變體中增至2倍，而在野生型中只增至1.7倍。在高鹽脅迫條件下離子含量的穩態對植物正常的生長至關重要，我們檢測了在高鹽脅迫條件下植物體內Na+和K+含量的變化。在正常生長條件下野生型和突變體中的Na+/K+比率并沒有明顯的區別，但是在100 mmol/L的NaCl的處理2 d后，amp1突變體中Na+/K+比率明顯低于野生型。這些結果表明AMP1負調控AHA3基因的表達，降低突變體中Na+的含量。

2.4 高鹽脅迫條件下amp1突變體的強抗氧化能力

為了驗證NaCl脅迫條件下amp1突變體抗氧化能力的強弱，我們檢測了在不同條件下野生型和amp1突變體中TBARS的含量（圖4）。實驗表明在正常生長條件下amp1突變體中TBARS的含量就比野生型中的區別不明顯，NaCl脅迫能使擬南芥植株中TBARS的含量升高，但amp1突變體中TBARS含量遠低于野生型的，結果表明amp1突變體中過氧化物的積累比野生型中的少，AMP1參與了植物非生物鹽脅迫介導的氧化脅迫應答反應。為了進一步探討amp1突變體中活性氧積累較少的原因，用實時熒光定量PCR檢測了與抗氧化防御系統相關基因表達水平的變化。ZAT10和ZAT12是一類含有C2H2鋅指結構的轉錄因子，參與植物的抗氧化反應過程［20］。我們發現在正常生長條件下，amp1突變體中ZAT10和ZAT12比野生型中的高（圖4），在高鹽脅迫條件下，amp1突變體中ZAT10和ZAT12也比野生型中的高。例如，在高鹽處理6 h時，ZAT10和ZAT12的表達量在野生型中分別增至1.5和1.2倍，在amp1突變體中分別增至2.1和1.8倍。這些結果表明擬南芥中AMP1通過調節ZAT10/12的表達水平進而調控對NaCl的應答反應。

3 討論

在世界范圍內，高鹽是一種非常重要的環境脅迫因子，它限制農作物產量，影響植物的生長和發育。高鹽不僅能對細胞產生毒害，影響植物體的離子平衡，還可以造成氧化和滲透脅迫［21］。為了克服這種限制因素，提高農作物的產量，研究植物的抗鹽反應機制顯得至關重要，因此鑒定新的抗鹽脅迫相關基因對通過分子生物學手段提高植物的抗鹽能力至關重要，本研究第一次發現了AMP1基因在擬南芥的抗鹽過程中起著重要的負調控作用。

圖3 野生型擬南芥與amp1突變體在NaCl處理下RD29A（A）、AHA3（B）表達量及Na+/K+比率（C）

圖4 野生型擬南芥與amp1突變體在NaCl處理下TBARS含量（A）、ZAT10（B）及ZAT12（C）表達量

研究證明，在逆境條件下包括高鹽脅迫植物會積累一些滲透調節物質，如可溶性糖和脯氨酸，用于平衡滲透壓對胞質的損傷，調節細胞膜的穩定性［22-24］。我們發現在高鹽脅迫下amp1突變體積累可溶性糖和脯氨酸的含量高于野生型，這些降低了突變體細胞的水勢，對抗高鹽條件下形成的滲透脅迫對植物的損傷。許多非生物脅迫可以誘導過氧化物的產生，對植物體造成氧化脅迫，損傷DNA和蛋白質分子，抑制植物正常的生長和發育［25］。在植物的抗氧化反應過程中ZAT10/12扮演著重要的作用，可誘導cAPX1、cAPX2和FDS1的表達，參與植物的抗鹽反應過程，抑制過氧化物對植物產生的毒害［26］。TBARS的分析結果表明在鹽脅迫下amp1突變體中積累了較少的ROS，可能是由于ZAT10/12在amp1突變體中的高表達，提高了amp1突變體的抗鹽能力。有研究表明在植物體中過表達ZAT10能夠提高抗鹽能力［26］。在高鹽脅迫條件下，除了降低植物體內過氧化物的水平，保持植物體內離子的穩態對植物的抗鹽能力也是至關重要的，植物可以通過提高Na+的外排和向液泡的運輸兩個途徑降低Na+對植物的毒害。我們的結果證明AMP1的缺失能夠促進Na+的外排，AMP1負調控AHA3基因的表達，降低突變體中Na+的含量。以上的結果表明在擬南芥中AMP1介導了抗鹽脅迫的信號傳導過程，AMP1缺失調控了抗鹽基因的表達，積累了較多的可溶性糖和脯氨酸，還調控了抗氧化基因和下游基因RD29A、AHA3的高表達，降低Na+的含量，提高突變體的抗鹽能力。

4 結論

本研究證明AMP1參與了擬南芥抗高鹽脅迫的反應過程，其缺失突變體amp1強的抗高鹽脅迫能力與其ZAT10/12介導的抗氧化防御能力和維持植物體內Na+的平衡能力正相關。另外，amp1突變體體內高含量的可溶性糖和脯氨酸也增強了其抗高鹽脅迫的能力。

本研究發現AMP1在擬南芥的鹽脅迫反應過程中起到一個負調控作用。amp1突變體對鹽脅迫不敏感的機制與以下三方面有關：（1）在鹽脅迫下amp1突變體中可溶性糖類和脯氨酸的含量升高，降低細胞的滲透勢對抗高鹽引起的滲透脅迫；（2）在鹽脅迫下amp1突變體中RD29A以及AHA3的高表達，后者可促進Na+的外排；（3）amp1突變體在鹽脅迫下的過氧化物的積累少，降低氧化脅迫對細胞的損傷。這些都提高了突變體的抗鹽能力。

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（責任編輯 狄艷紅）

Arabidopsis AMP1 Negatively Modulates Plant Responses to Salt Stress

Xia Jinchan1He Jinhuan2
（1. Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450008；2. Henan University of Animal Husbandry and Economy，Zhengzhou 450008）

Salt stress severely affects the growth and development of plants and crop yield， therefore it is crucial to identify the related genes responding to salt stress in plants. Altered Meristem Program（AMP1）of Arabidopsis， encoding a putative glutamate carboxypeptidase， is involved in plant growth， photomorphogenesis and seed dormancy. In this study， we revealed new function of AMP1， i.e.， its deficiency increased the capacity of salt resistance in deletion mutant amp1. The study convinced that phenotype of solid salt resistance resulted from 2 aspects：firstly the accumulating more betaine and proline in mutant than in wild one led to the decrease of cell potential in the mutants， and secondly the expression of downstream gene RD29A and AHA3 in the mutants was higher than that in wild ones and the latter promoted the exocytosis of Na+. The salt stress also triggered the oxidation stress in the plants； the study discovered that the deletion of AMP1 up-regulated the expression of antioxidant gene ZAT10/12， consequently lowered the accumulated level of peroxide in amp1 mutants， and thereby diminished the damages to cells and the prohibition of growth. All of them jointly enhanced the capacity of salt resistance in amp1 mutants. Our results proved that Arabidopsis AMP1 negatively regulated plant responses to salt stress.

AMP1；salt stress；ZAT10/12；RD29A

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.012

2014-12-22

河南中醫學院博士基金項目（BSJJ2010-35）

夏金嬋，女，博士，研究方向：分子生物學；E-mail：epsalon@163.com