急性胃黏膜損傷大鼠前爪不同區域血含量及特定部位黑色素含量變化的研究

秦培潔　王柳青　程志立　狄　穎　劉劍鋒

中國中醫科學院中國醫史文獻研究所，北京100700

急性胃黏膜損傷大鼠前爪不同區域血含量及特定部位黑色素含量變化的研究

秦培潔王柳青程志立狄穎劉劍鋒▲

中國中醫科學院中國醫史文獻研究所，北京100700

目的探討生理、病理狀態下大鼠上肢手掌不同區域血含量和上肢手掌皮膚黑色素變化，為氣色形態手診乃至中醫學的“司外揣內”提供合理的研究方法和實驗依據。方法隨機將SD雄性大鼠20只分為正常組和模型組，每組各10只。利用無水乙醇灌胃復制急性胃損傷模型后，兩組分別從大鼠尾靜脈中給予一定濃度的伊文斯蘭（EB）生理鹽溶液。通過測量手掌不同部位組織內EB的吸光度（A）值大小，間接反映手掌各區域血含量的變化情況。利用多巴氧化酶檢測兩組大鼠前爪皮膚黑色素變化。結果①模型組大鼠前爪5區的A值（0.96±0.46）顯著高于正常組（0.35±0.17），差異有高度統計學意義（P＜0.01）。②模型組大鼠5區的黑色素細胞增多。結論應激性胃潰瘍的大鼠的病理變化可以在手掌特定區域反映出，初步推斷這種變化是通過血流量的變化和手掌皮膚的黑色素變化實現的。

手診；急性胃黏膜損傷；大鼠前爪；血含量；黑色素含量

氣色形態手診是在中醫望色診病理論基礎上建立起來的，對受傷特定部位的氣、色、形態變化進行有目的的觀察，并對收集到的信息進行分析，以了解人體健康狀況的一種診斷方法［1-3］。本研究探討生理、病理狀態下大鼠上肢手掌不同區域血含量和上肢手掌皮膚黑色素變化，為氣色形態手診乃至中醫學的“司外揣內”提供合理的研究方法和實驗依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物與主要試劑

SD雄性大鼠（8周齡）20只，平均體重（250± 10）g（中國軍事醫學科學院提供，批號：0019071）。伊文斯蘭（Evans blue，EB）（FLU KA進口分裝），75%乙醇（上海利康消毒高科技有限公司），多巴胺氧化酶（DopA）（Cayman），磷酸氫二鈉（biotopped），磷酸氫二鉀（福晨化學），甲醛溶液（sigma），硫酸鋁（sigma）。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組

將20只大鼠適應性喂養1周后，隨機分為兩組，正常組和急性胃黏膜損傷模型組（模型組），每組各10只。

1.2.2模型建立

模型組大鼠按照2 mL/kg比例腹腔注射0.9% NaCl溶液，1 h后用75%乙醇，按照1 mL/100 g比例進行灌胃，進而誘導成急性胃黏膜損傷模型；正常組大鼠則按照2 mL/kg比例腹腔注射0.9%NaCl溶液。1.3觀察指標

1.3.1形態學觀察

肉眼觀察兩組大鼠的胃大體標本和前爪特定部位的皮膚標本。

1.3.2胃潰瘍指數

用4%甲醛溶液固定各組大鼠的胃組織，沿胃大彎剪開，顯微鏡下觀察出血性病灶，采用測微尺計算胃黏膜損傷面積。計分標準：0分：正常胃黏膜；1分：點狀損傷；2分：病損＜1 mm；3分：1 mm≤病損＜2 mm；4分：2 mm≤病損＜3 mm；依次類推，胃潰瘍指數=全胃評分的總和［1］。

1.3.3組織病理學檢查

取大鼠胃竇部組織，石蠟切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察大鼠胃壁4層結構是否清晰，胃黏膜表面是否光滑，上皮是否完整，腺體排列是否整齊。

1.3.4大鼠前爪特定部位血含量變化測定方法

1.3.4.1EB標準曲線的制作根據參考文獻［2］結合本實驗的要求進行改良，丙酮和生理鹽溶液按照7∶3混合后中加入EB，配制成溶度為25、125、625、3.12、1.56、0.78、0.39 μg/mL的溶液。用722型分光光度計在600 nm測量吸光度（A）值，測量方法：在600 nm處用722型分光光度計測得，其中濃度為橫坐標，A值為縱坐標。從圖1可見EB溶度與A值之間存在較好的線性關系，其回歸直線方程：Y=0.028X+0.027，r=0.9990，為EB標準曲線。

圖1　EB標準曲線

1.3.4.2實驗方法大鼠適應性飼養1周后，禁食不禁水24 h，術前2 h禁水。模型組大鼠按照2 mL/kg比例腹腔注射0.9%NaCl溶液，1 h后用75%乙醇，按照1 mL/100 g比例進行灌胃，進而誘導成急性胃黏膜損傷模型；空白組大鼠則按照2 mL/kg比例腹腔注射0.9%NaCl溶液，1 h后按照1 ml/100 g比例用0.9% NaCl溶液灌胃。2 h后麻醉取胃，脫頸椎處死大鼠后迅速從前肢肘后剪下前爪，放2℃冰箱冰箱冷藏10 min后取出固定在塑料泡沫上，放入液氮中，進而轉移到-20℃冰箱冷凍。依據大鼠前爪蹼的分布特點，參考氣色形態手診特點［3］，由圖2可見沿蹼邊界將大鼠前爪分為9個區域［4］，每區分別取區域內肌健以上組織，放7∶3丙酮生理鹽溶液中浸泡72 h，以1500 r/min離心10 min，用722型分光光度計在600 nm處測量上清液的A值［5］。

圖2　大鼠前爪分區

1.3.5大鼠前爪特定部位黑色素變化測定［6-8］

1.3.5.1試劑配制0.0056 mol/L DopA液的配制：稱取DopA 1.10 g，溶解于1000 mL蒸餾水。0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）配制：A液，0.1 mol/L磷酸氫二鈉35.8 g溶解于1000 mL蒸餾水；B液，磷酸二氫鉀13.6 g溶解于1000 mL蒸餾水；取A液9份與B液1份混合，pH調至7.4。孵育液配制法：0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4），溶入0.0056 mol/L的DopA內。將配制好的孵育液保存于冰箱內備用。

1.3.5.2操作步驟取大鼠5區皮膚作為標本，用10%甲醛固定組織1 h（22℃）或4～8 h（4℃），修切已固定的組織塊，厚3～5 mm，流水沖洗3 min，組織塊浸于孵育液中1 h（37℃）流水沖洗2～6 h，在Bouin液中重新固定24 h。各級乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片厚度8 μm，用5%硫酸鋁水溶液配制的0.1%核固紅，復染10 min，流水沖洗片刻至核深紅色，胞質帶紅色為止。最后脫水、透明，中性樹膠封片。

1.4統計學方法

采用統計軟件SPSS 17.0對數據進行分析，正態分布計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1胃潰瘍形態學觀察

正常組和模型組大鼠胃大體的形態學觀察特點總結見表1，具體形態見圖3～4（封三）。

表1　大鼠胃潰瘍形態學觀察

2.2胃潰瘍指數

與正常組比較，模型組的胃潰瘍指數（78.39±15.98）顯著升高，差異有高度統計學意義（P＜0.01），提示造模成功。

2.3組織病理學觀察

空白組大鼠的胃沒有明顯的炎癥細胞浸潤，具有較為完整的胃黏膜，黏膜、黏膜下層、肌層及漿膜層結構完整，胃小凹結構和黏膜腺體排列整齊。見圖5（封三）模型組大鼠的胃黏膜結構排列紊亂，黏膜上皮層在部分區域缺失，甚至累及胃黏膜固有腺體，并伴有大量炎癥細胞浸潤，潰瘍床有肉芽組織形成。見圖6（封三）。

2.4大鼠前爪特定部位血含量變化

正常組大鼠前爪各區的A值普遍較低。模型組大鼠前爪除5區外，其他均未明顯升高（P＞0.05）；而模型組大鼠前爪5區的A值則明顯升高，顯著高于正常組，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。見表2。

2.5大鼠前爪特定部位黑色素變化

由圖7～8（封三）可見，與正常組比較，模型組的黑色素細胞增多。

表2　大鼠前爪特定部位血含量變化±s）

表2　大鼠前爪特定部位血含量變化±s）

正常組模型組P值0.35±0.06 0.36±0.12 0.69 0.36±0.12 0.37±0.10 0.75 0.37±0.18 0.37±0.16 0.72 0.35±0.05 0.36±0.12 0.81 0.35±0.17 0.96±0.46 0.00 0.36±0.06 0.37±0.18 0.62 0.34±0.16 0.38±0.15 0.81 0.37±0.13 0.37±0.08 0.67 0.34±0.13 0.39±0.15 0.71組別1區2區3區4區5區6區7區8區9區

3　討論

氣色形態手診時在中醫望色診病理論基礎上建立起來的，在傳統中醫理論指導下結合臨床實踐由劉劍鋒教授首次提出的創新中醫診斷方法。20多年來已在臨床實踐中得到了大量的驗證和推廣［9-12］。在大量臨床實證的基礎上，近年來課題組致力于尋找氣色形態手診的機制以期為中醫“司外揣內”理論提供研究方法和實驗依據。在氣色形態氣色形態手診理論中，胃區位于手掌的正中心，呈正圓形，向左不超過生命線，向右不超過無名指豎直平分線，而在病理狀態下，該區的氣色形態將發生一定的改變［3］。

通過本課題組的前期研究發現，臨床和實驗中多用EB作為血清蛋白的標志物測定血漿容量［11］，對于應激性胃潰瘍這種急性損傷而言，一方面考慮是該區域血含量發生變化而導致視覺上的變化，另一方面考慮是否導致該區域黑色素細胞增加進而會有視覺上的改變。基于此假設，本課題組開展了研究，發現模型組大鼠前爪的5區A值也就是胃區的A值顯著高于正常組，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。說明假設成立，應激性胃潰瘍可導致大鼠前爪胃區的血流含量發生變化進而引起視覺的改變，進一步驗證了本課題組前期的工作。本研究采用多巴氧化酶法［13-14］檢測各組大鼠前爪皮膚黑色素情況，通過圖7～8（封三）可以看出模型組大鼠的5區黑色素細胞明顯增多，為假設提供了初步佐證，至于其機制如何，有待課題組的進一步研究。

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Research of blood content in the forepaw different regions and melanin content of particular part in acute gastric mucosa injury rats

QIN PeijieWANG LiuqingCHENG ZhiliDI YingLIU Jianfeng▲
Institute of Chinese Medical History Literature，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing100700，China

Objective To investigate the change of blood content and melanin in different area of forepaw skin in rat under physiological and pathological conditions，in order to provide reasonable research methods and experimental basis for hand diagnosis and Qisexingtai of traditional Chinese medicine.Methods Twenty SD rats were randomly divided into two groups，normal group and model group，with 20 rats in each group.Acute gastric mucosal injury model was established by intragastric administration of anhydrou ethanol.Rats tail vesns were injected a certain concentration Evan blue（EB）saline solution.Then，by detecting the photo-absorption rate（A value）of the EB in the tissues of the different zones of forepaws，the changes of blood contents in the different areas was examine indirectly.The melanin of rat forepaw skin was detected by dopa oxidase.Resluts①The A values in 5 zones of model group（0.96±0.46）was higher than that of normal group（0.35±0.12），the differences was statistically significant（P＜0.05）.②The melanin in 5 zones were significantly increased.Conclusion The pathological changes of stress ulcer in rats can be reflected on particular area of forepaw in acute gastric mucosa injury rats，preliminary conclusion the change is realized through the blood flow change and the palmar skin melanin change.

Hand diagnosis；Acute gastric mucosa injury；Rat forepaw；Blood content；Melanin content

R241

A

1673-7210（2015）05（c）-0004-04

2014-11-01本文編輯：蘇暢）

國家自然科學基金資助項目（81173197）。