Lenti—Toll樣受體4—siRNA的構建及對大鼠肺泡巨噬細胞NR8383的影響

張小藝+孟紅艷+彭敏+司皓+馬宏博

[摘要] 目的 構建Toll樣受體（TLR）4基因慢病毒表達載體介導的小干擾RNA（siRNA），觀察其對大鼠肺泡巨噬細胞NR8383 TLR4的沉默效應。 方法 設計4條針對TLR4基因的siRNA靶序列，經合成、退火、酶切，與線性載體GV115連接，轉入細菌感受態細胞，經聚合酶鏈反應（PCR）篩選陽性克隆、測序鑒定。共轉染293T細胞，包裝產生慢病毒顆粒，分別感染NR8383細胞，實時定量PCR（RT-PCR）檢測NR8383細胞TLR4 mRNA的表達。根據篩選結果，選取最有效的載體進行病毒大量包裝。 結果 經測序驗證，慢病毒載體構建成功并獲得相應的慢病毒，NR8383細胞感染慢病毒后，TLR4基因mRNA表達明顯下降，LV-TLR4-RNAi（Tgt-2）作用較明顯，敲減效率達到65%。 結論 成功構建針對靶向大鼠TLR4基因的RNAi慢病毒載體，為進一步研究TLR4信號通路在急性肺損傷中的作用奠定基礎。

[關鍵詞] Toll樣受體（TLR4）；RNA干擾；慢病毒

[中圖分類號] R392 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）10（b）-0004-05

Construction of Lenti-TLR4-siRNA and its effect on rat alveolar macrophage NR8383

ZHANG Xiaoyi1 MENG Hongyan1 PENG Min1 SI Hao2 MA Hongbo1

1.Department of Traditional Chinese Medicine， Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University， Shandong Province， Ji′nan 250021， China； 2.School of Public Health， Shandong University， Shandong Province， Ji′nan 250012， China

[Abstract] Objective To construct the lentiviral vector-mediated small interfering RNA（siRNA） of TLR4， and examine the silent effect on the rat alveolar macrophage NR8383. Methods 4 siRNA sequences targeting TLR4 gene were designed. After synthesis， annealing and restriction enzyme digestion， TLR4-RNAi were ligated with GV115， transformed into competent bacterial cells， and confirmed by PCR and DNA sequencing. 293 T cells were co-transfected. The four kinds of recombinant lentiviruses were used to infect NR8383 cells， and the expression levels of TLR4 mRNA were detected by RT-PCR. According to the result， the most effective vector was selected for viruses amounts of packaging. Results 4 Lenti-TLR4-siRNA sequences were successfully inserted into the lentiviral vectors. The TLR4 expression in NR8383 cells infected with lentiviral vectors was significantly inhibited at mRNA levels when compared with that in the non-transfected and empty vector-transfected NR 8383 cells. The effect was most significant in NR8383 cells infected with LV-TLR4-RNAi（Tgt-2）. The TLR4 mRNA expression was decreased by 65%. Conclusion Successful construction of lentiviral vector RNAi on rat with targeted TLR4 gene lay the foundation for further studying the role of TLR4 signaling pathway in acute lung injury.

[Key words] Toll like receptor 4； RNA interference； Lentivirus

內毒素（lipopolysaccharide，LPS）是導致急性肺損傷（acute lung injury，ALI）的重要因素，Toll樣受體（Toll like receptor，TLR）是LPS信號向細胞內傳導的“門戶蛋白”[1]，其信號通路的過度激活是導致炎性反應爆發失控的重要機制。TLR4可以選擇性識別LPS，LPS與單核巨噬細胞、中性粒細胞等免疫細胞細胞膜上的TLR4結合，引起炎癥瀑布效應[2]。調節TLR4信號通路有可能成為膿毒癥的一種治療策略[3]。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）近年來取得相當大的進展，研究人員利用RNAi作為研究工具引入到細胞或整個生物RNAi試劑，用以識別新的細胞通路和潛在的藥物靶點[4]。慢病毒載體是一種高效率的轉基因和基因治療工具，其最大優勢在于能夠感染分裂和靜止狀態下的細胞，并且能夠高效、穩定地整合于宿主細胞內[5]。本實驗通過構建TLR4 siRNA慢病毒載體，轉染至大鼠巨噬細胞NR8383，并通過實時定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測TLR4 siRNA干擾的效果，為進一步探討TLR4信號通路在ALI發生、發展中的機制提供研究工具。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

聚合酶鏈反應（PCR）反應試劑，Primer（R&F）合成、dsDNA oligo、293T細胞株、大腸埃希菌菌株DH5α、病毒載體均由上海吉凱基因化學技術有限公司提供；Taq酶、SYBR Master Mixture購于TaKaRa；Age Ⅰ、EcoR Ⅰ、T4 DNA ligase、T4 DNA ligase buffer來自于NEB；QIAGEN Plasmid大抽Kit來自QIAGEN；Rnase Inhibitor、dNTP、M-MLV逆轉錄酶購于Promega；Lipofectamine 2000、Trizol購自Invitrogen；ECL-PLUS/Kit購于Amersham公司；positive clone測序由上海美季生物技術有限公司完成；胎牛血清、DMEM購自Gibco公司；Opti-MEM購自Invitrogen。

1.2 方法

1.2.1 TLR4基因RNAi慢病毒載體構建

1.2.1.1 siRNA靶點設計 針對TLR4目的基因靶基因序列，采用Invitrogen軟件（https：//rnaidesigner.invitrogen.com/sirna/）設計4個RNA干擾靶點序列。見表1。

表1 TLR4 siRNA靶點設計

1.2.1.2 RNAi慢病毒載體構建 工具載體選擇GV115，框架結構為hU6-MCS-CMV-EGFP，酶切位點：Age Ⅰ，EcoR Ⅰ。合成含干擾序列的DNA oligo，經退火形成雙鏈DNA，與經Age Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切后的載體連接。見表2。

1.2.1.3 克隆制備與鑒定 通過T4 DNA ligase將酶切回收的載體和DNA片段進行鏈接反應，將鏈接產物轉入制備好的DH5α細菌感受態細胞，挑取轉化子重懸于10 μL LB溶液，使用GV115通用引物，進行菌落PCR鑒定實驗。將PCR陽性克隆進行測序，經結果比對，確認測序引物與鑒定引物中的上游引物相同即為構建成功的TLR4目的基因RNAi慢病毒載體。測序結果通過Chromas軟件進行分析。PCR鑒定陽性克隆的引物為：上游5′-CCATGATTCCTTCATATTTGC-3′，下游5′-CGCGTGGATAACCGTATTAC-3′。PCR鑒定的分組為1：陰性對照（ddH2O）；2：陰性對照（空載）；3：Marker自上而下依次為5 kb、3 kb、2 kb、1.5 kb、1 kb、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp；4：TLR4-RNAi轉化子（a：Tgt-1；b：Tgt-2；c：Tgt-3；d：Tgt-4）。

1.2.2 RNAi慢病毒小量包裝

制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質粒及其兩種輔助包裝原件載體質粒，分別進行高純度無內毒素抽提，在Lipofectamine 2000介導下共轉染293T細胞，培養8 h后倒去含有轉染混合物的培養基，加入含10%血清的細胞培養基，繼續培養48 h，收集293T細胞上清液，過濾離心后取病毒濃縮液，分裝后保存在病毒管中，-80℃保存，取1支以熒光法進行病毒生物學滴度測定。

1.2.3 慢病毒感染細胞

1.2.3.1 細胞培養 實驗細胞大鼠肺巨噬細胞株NR8383購自ATCC公司，培養于含15%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）、L-谷氨酰胺（2 mmo/L）、NaHCO3（1.5 g/L）的Ham′s F12培養基中，細胞在37℃、5%CO2條件下培養，在對數生長期進行實驗。

1.2.3.2 NR8383細胞慢病毒感染 將處于對數生長期的大鼠肺泡巨噬細胞NR8383進行胰酶消化，制成細胞懸液，接種于6-well培養板培養，待細胞融合度達到約30%，按設計組別分別加入慢病毒顆粒進行NR8383細胞的感染實驗，12 h后觀察細胞狀態，如無明顯細胞毒性，連續培養24 h后更換培養基。感染3 d后熒光顯微鏡下觀察GFP表達，熒光率達80%以上，收集細胞，感染效率低于80%的實驗組，重新進行感染實驗。見表3。

1.2.4 qPCR內源篩靶

收集生長狀態良好的目的細胞，提取RNA，總RNA抽提根據Trizol操作說明書進行。RNA逆轉錄獲得cDNA，按照M-MLV操作說明書進行，采用RT-PCR檢測目的基因的表達情況。TLR4上游引物序列：5′-ATGAGGACTGGGTGAGAAACG-3′，下游引物序列：5′-ATGCCAGAGCGGCTACTCA-3′，擴增長度：247 bp；內參GAPDH上游引物序列：5′-TTCAACGG-CACAGTCAAGG-3′，下游引物序列：5′-CTCAGCAC-CAGCATCACC-3′，擴增長度：114 bp。用TP800序列檢測系統軟件（TaKaRa公司）制作擴增曲線并進行數據分析，依據2-ΔΔCt數據分析法，比較各組TLR4基因mRNA表達水平。

1.2.5 有效靶點慢病毒大量包裝及驗證內源性目的基因表達敲減

根據RT-PCR結果，篩選出敲減效率最高的1個RNAi有效靶點，進行慢病毒大量包裝。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行分析和處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 陽性克隆的PCR鑒定

載體上的引物進行PCR鑒定陽性克隆，經瓊脂糖凝膠電泳檢測其大小和完整性，每個序列陽性克隆各取3個樣品菌種送上海美季公司測序，結果通過Chromas軟件進行分析。鑒定電泳結果顯示，TLR4 vshRNA片段已經成功插入質粒，挑選的陽性克隆菌液測序結果與實驗要求的DNA序列完全一致。見圖1。

2.2 慢病毒滴度測定

測定前1 d為293T細胞鋪板，每孔加4×104個細胞，在Eppendorf管中加入90 μL無血清培養基，將10 μL病毒原液加入到第1個管中，混勻后取10 μL加入到第2個管中，如此分別稀釋為1/10～1/100萬，感染293T細胞，24 h后加入完全培養基100 μL，4 d后，觀察綠色熒光蛋白表達，通過GFP陽性細胞計數法測定LV-TLR4-RNAi（Tgt-1、2、3、4）的滴度分別為5×108、4×108、4×108、5×108 TU/mL。

2.3 慢病毒感染細胞

感染后16 h更換培養基，感染后96 h熒光拍照。圖2顯示各組慢病毒成功感染NR8383細胞。

圖2 熒光顯微鏡下慢病毒感染NR8383細胞GFP的表達（100×）

2.4 RT-PCR內源篩靶

RT-PCR檢測結果顯示，NR8383細胞中，相對于陰性對照組，KD2組TLR4基因敲減效率達到65%（P < 0.05）（圖3，封三），認為是KD2有效靶點。

2.5 病毒大量包裝后的靶點再次驗證

根據RT-PCR篩選結果，選取敲減效率最高的KD2號靶點進行病毒的大量包裝后，經定量PCR測定，在NR8383細胞中，相對于NC、KD2組TLR4基因敲減效率達到90.1%（P < 0.05）。

3 討論

ALI發病的關鍵是一種肺內過度性、失控性的炎性反應，多種炎癥細胞和炎癥介質相互的激活與釋放，導致瀑布式的炎性反應，形成肺的過度損傷[6-7]。研究表明，ALI患者TLR4的表達水平與急性肺部炎癥程度及氣道上皮細胞的損傷、肺部中性粒細胞增加相關[8]。TLR4可以早期識別侵入體內的細菌啟動炎性反應，核因子（NF）-κB、激活蛋白-1（AP-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）等的激活均為其下游事件，最終導致多種炎性因子的瀑布式釋放，放大炎癥效應[9]。研究證實，TLR4基因缺陷小鼠對內毒素的敏感性明顯下降，肺組織病理損傷和肺水腫程度減輕[10]，以TLR4基因為靶點，從上游調控這種瀑布式的炎癥效應，可為治療急性感染性疾病提供一種新的策略[11]。

RNAi技術是近年來發現的一種重要的基因沉默技術，RNAi能夠非常特異地降解與之序列相應單個內源基因mRNA，相對少量的dsRNA就可以使表型達到缺失突變體程度，抑制基因表達效率很高[12-14]，已成為研究信號傳導通路的良好工具。RNAi技術在調節免疫系統增強免疫反應、控制炎癥和治療自身免疫性疾病中都發揮了作用[15]。

RNAi的沉默效應與基因的轉染效率密切相關[16]。基因轉染的方法可分為病毒轉染和非病毒轉染，常用的病毒載體包括逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒和腺相關病毒載體[17]。慢病毒載體是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒（HIV-1）為基礎發展起來的基因治療載體，可感染分裂細胞及非分裂細胞，轉移基因片段容量較大，目的基因表達時間較長，還可整合到宿主細胞的染色體基因組上，不易引發宿主免疫反應[18-20]，已成為基因功能研究及基因治療領域中熱門的基因轉移載體[21]。

本研究成功構建了4個TLR4基因RNAi慢病毒表達載體，具有較高滴度，4種慢病毒載體感染大鼠肺巨噬細胞NR8383后，TLR4基因mRNA表達量均明顯下降，其中LV-TLR4-RNAi（Tgt-2）抑制作用最明顯，使mRNA表達下降65%，將2號靶點進行病毒的大量包裝后，TLR4基因敲減效率達到90.1%，表明本研究構建的慢病毒RNAi表達載體在NR8383細胞內能有效地沉默TLR4基因表達，為后續研究TLR4信號通路在ALI發病過程中的作用及中藥干預的靶點奠定了基礎。

[參考文獻]

[1] S？覿emann MD，Weichhart T，Zeyda M，et al. Tamm-Horsfall glycoprotein links innate immune cell activation with adaptive immunity via a Toll-like receptor-4 dependent mechanism [J]. J Clin Invest，2005，115（2）：468-475.

[2] 王晶晶，楊敬平，齊明祿.TLR4介導的信號通路與膿毒癥相關性研究[J].臨床肺科雜志，2015，20（4）：725-727.

[3] Wittebole X，Castanares-Zapatero D，Laterre PF. Toll-like receptor 4 modulation as a strategy to treat sepsis [J]. Mediators Inflamm，2010，2010：568396.

[4] Stephanie EM，Jennifer AS，Caroline ES，et al. RNAi screening comes of age：improved techniques and complementary approaches [J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2014，15（9）：591-600.

[5] 張曼，孫秀萍，宋銘晶.慢病毒載體用于轉基因技術的研究進展[J].中華臨床醫師雜志：電子版，2014，8（10）：1949-1953.

[6] 李玉梅，衛洪.ALI/ARDS抗炎治療研究的策略與展望[J].中國病理生理雜志，2009，25（4）：813-816，825.

[7] 雷馬文，王德明.miRNA：急性肺損傷中新的調控分子[J].中國現代醫生，2013，51（11）：27-28.

[8] Togbe D，Schnyder-Candrian S，Schnyder B，et al. TLR4 gene dosage contributes to endotoxin-induced acute respiratory inflammation [J]. J Leukoc Biol，2006，80（3）：451-457.

[9] 唐婧，莫中成，王德明.TLR4在急性肺損傷中的作用[J].中南醫學科學雜志，2013，41（5）：516-519.

[10] 張進祥，王慧，徐建波，等.Toll樣受體4在急性肺損傷中的作用[J].中華急診醫學雜志，2006，15（8）：692-695.

[11] 王娜，張雪梅，陳立杰.TLR4信號通路與炎癥相關性疾病[J].中國實驗診斷學，2015，19（5）：857-860.

[12] Moffat J，Sabatini DM. Building mammalian signalling pathways with RNAi screens [J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2006，7（3）：177-187.

[13] 李再新，王慧.RNAi作用機制及其應用研究進展[J].四川理工學院學報：自然科學版，2005，18（3）：19-21.

[14] Chad VP，George AC，Robert LC，et al. RNA interference in the clinic：challenges and future directions [J]. Nat Rev Cancer，2011，11（1）：59-67.

[15] Chih-PM，YenYL，ChienFH，et al. Immunological research using RNA interference technology [J]. Immunology，2007，121（3）：295-307.

[16] 阮靜，王旭，李煜生，等.沉默Toll樣受體4基因表達的RNAi慢病毒載體的構建[J].中國組織工程研究與臨床康復，2011，15（20）：3693-3696.

[17] 陳巖，賴垂金，李雯，等.不同基因轉染方法對小鼠內耳毛細胞轉染效率的比較[J].聽力學及言語疾病雜志，2015，23（2）：166-169.

[18] 喻鈞，潘鐵成，魏翔，等.TLR3基因RNAi慢病毒載體的構建與鑒定[J].華中科技大學學報：醫學版，2013，42（2）：167-171.

[19] 丁震宇，梁后杰.慢病毒載體介導的RNAi的研究進展[J].醫學研究雜志，2009，38（4）：15-19.

[20] 孟凡榮，陳琛，萬海粟，等.慢病毒載體及其研究進展[J].中國肺癌雜志，2014，17（12）：870-876.

[21] Pluta K，Kacprzak MM. Use of HIV as a gene transfer vector [J]. Acta Biochim Pol，2009，56（4）：531-595.

（收稿日期：2015-06-08 本文編輯：李亞聰）