HPLC測定馬甲子藥材中馬甲子1#的含量

宋聯強 ， 武蕊娟 ， 譚 鐳 ， 詹 雁 ， 阮 佳 ， 徐超群

（1.成都中醫藥大學，四川 成都 610075；2.四川省中醫藥科學院，四川 成都 610041）

0 引 言

馬甲子 Paliurus ramosissimus（Lour.）Poir.系鼠李科銅錢屬植物，又名鐵籬笆、銅錢樹。其根部具有發表解熱，祛風利濕，治跌打損傷及心腹疼痛的功能，其葉具有治癰瘡潰瘍作用[1]。經本課題組的前期研究證實其葉也具有抗腫瘤作用且療效較好。為了探索馬甲子葉中的相關活性成分，本文對馬甲子葉中的某些成分進行了提取分離、結構鑒定和抗腫瘤等方面的研究，得到了新的活性單體馬甲子1#，為了進一步研究該成分，制定了本文的含量測定方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

1200高效液相色譜儀（美國安捷倫）；Sartorius BS210S電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）。

乙腈（色譜純，美國Sigma公司）；水（樂百氏純凈水）；甲酸、甲醇 (分析純,成都市科龍化工試劑廠）。

藥材：于2013年6月采自四川省牧馬山的鮮葉，經鑒定為鼠李科銅錢屬植物馬甲子Paliurus ramosissimus（Lour.）Poir.，冷凍干燥備用；馬甲子1#對照品（成都普瑞法科技開發有限公司，批號：14070109），純度經歸一化法測定為97.4%。馬甲子1#經結構鑒定，未見相關文獻報道，屬于新化合物，結構式見圖1。

圖1 馬甲子1#結構式

1.2 方法與結果

1.2.1 色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱為BDS HYPERSIL C18色譜柱（4.6mm×100mm×2.4μm，Thermo Fisher Scientific）；以乙腈為流動相A，0.1%甲酸溶液為流動相B，按表1進行梯度洗脫；檢測波長為320 nm；柱溫為30℃；流速為1.0mL/min；進樣量為10μL。理論塔板數按馬甲子1#計算應不低于3000。分別選擇乙腈-水，乙腈-0.1%冰醋酸溶液，乙腈-0.1%甲酸溶液為流動相，考察不同流動相系統對樣品的分離效果。結果表明，采用乙腈-0.1%甲酸溶液系統時主峰與雜質峰分離較好，且分離度＞1.5，故選擇乙腈-0.1%甲酸溶液系統。在小范圍內改變進樣體積、柱溫及流速，色譜圖無明顯變化。對照品和供試品溶液的色譜圖分別見圖2（a）和圖 2（b）。

1.2.2 樣品的制備

精密稱取馬甲子1#對照品適量，用甲醇制成含馬甲子1#0.1068mg/mL的對照品貯備液。分析測試中所用對照品溶液由對照品貯備液稀釋得到。

取馬甲子藥材粉末（過4號篩）約2.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入95%乙醇50mL，稱定質量，回流提取2h后，取出，冷卻，再稱定質量，用95%乙醇補足損失的質量，搖勻，濾過，即得供試品溶液。

1.2.3 線性范圍考察

分別精密移取馬甲子1#對照品貯備液0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，8.0mL 置于 10mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。按“1.2.1”項下的色譜條件測定馬甲子1#的峰面積，并以進樣量對其峰面積進行線性回歸，得到回歸方程為：Y馬甲子1#=2.396×103X-4.758（r=0.9999）。結果表明馬甲子1#在0.021 4～0.854 4 μg范圍進樣量與峰面積線性關系良好。結果見圖3。

圖2 對照品和供試品溶液的色譜圖（HPLC）

表1 HPLC梯度洗脫條件

1.2.4 精密度試驗

取含馬甲子1#0.021 36 mg/mL的對照品溶液，重復進樣5次，計算馬甲子1#峰面積的RSD為0.73%，結果表明進樣精密度良好。

1.2.5 重復性試驗

取同一批號的馬甲子藥材粉末（過4號篩）6份，按“1.2.2”項方法制備供試品溶液，測定，計算馬甲子1#含量的RSD為0.70%，結果表明方法重復性良好。

圖3 馬甲子1#標準曲線

1.2.6 穩定性試驗

取同一對照品溶液，于室溫下 0，2，4，6，8，12，24h分別進行測定，以峰面積為指標計算馬甲子1#的RSD為1.05%，結果表明供試品溶液在24h內穩定。

1.2.7 加樣回收率試驗

稱取已測定含量的馬甲子藥材粉末（過4號篩）約2.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，共6份，分別精密加入對照品貯備液5mL，精密加入95%乙醇50mL，按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液，測定，結果表明回收率較好（見表2）。

1.2.8 樣品測定

在本文色譜條件下，被測成分與其他化合物色譜峰分離度均良好。對10批馬甲子藥材進行測定，結果見表3。

2 討 論

馬甲子藥材中馬甲子1#含量的測定試驗，通過前期單因素試驗考察了馬甲子1#的提取工藝，并從操作便捷性和節約資源等方面綜合考慮最終確定了供試品溶液的制備方法。用本文色譜條件測定10批馬甲子藥材中馬甲子1#的含量，其中批號140523的藥材中馬甲子1#含量最高，同時該批次馬甲子藥材抗腫瘤活性最強，由此進一步確定其為馬甲子藥材抗腫瘤活性成分之一。馬甲子1#含量的測定能夠初步評價不同產地、不同采收期馬甲子藥材的質量，為民間癌癥患者用藥提供了一定的參考。

表2 加樣回收率測定結果

表3 10批藥材中馬甲子1#含量

3 結束語

目前對馬甲子的研究主要集中在其根、莖、果實中化學成分的分離鑒定[2-4]，而馬甲子葉中化學成分的研究未見報道。馬甲子1#屬于從馬甲子葉中分離得到具有白樺酸母核的新的五環三萜類化合物[5-10]，具有一定的抗腫瘤活性，有較好的研究前景。本文所建立的HPLC法能有效地將馬甲子藥材中馬甲子1#與其他成分分開，分離度＞1.5，且峰形較好，分析時間短，為馬甲子1#定量分析提供了參考，為后期的深入研究奠定了一定的基礎。

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