不同品種藥用菊花綠原酸和黃酮類溶出規律的研究

賈國梁1 楊 茜2

【摘 要】目的：通過建立HPLC法測定3種菊花中2種有效成分，并用此方法探討有效成分的溶出規律。方法：采用Hypersil BOS C18 色譜柱（4.6×250 mm，5 ?m）；以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相，梯度洗脫，流速為1.0 ml/min；柱溫為25 ℃；紫外-可見光檢測器，檢測波長為210 nm。結果：在20min 內菊花中綠原酸和黃芩苷能與其他成分完全分離，綠原酸先溶出。結論：本實驗采用HPLC法，對綠原酸和黃芩苷的分離效果好，靈敏度高，準確，可用于多種菊花樣品的分析測定。

【關鍵詞】HPLC；菊花；溶出規律

菊花（Flos Chrysanthemi）為菊科植物菊（Chrysanthemum morifolium Ramat）的頭狀花序，具有疏風清熱、明目解毒的功效，主要治療頭痛、眩暈、目赤、心胸煩熱、疔瘡、腫毒等癥。黃酮類化合物為菊花最主要的有效成分之一，在生命科學，制藥，食品等領域都具有非常重要的意義[1-2]。目前文獻報道[3-5]的菊花的黃酮主要有：香葉木素、木犀草素、芹菜素、香葉木素7-O-β-D葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D葡萄糖苷、金合歡素7-O-β-D葡萄糖苷、刺槐苷、金合歡素7-O-（6-O-乙酰）-β-D葡萄糖苷、金合歡素；多酚類化合物主要為綠原酸。

本研究采用水煎煮法對不同煎煮時間點的不同品種菊花中主要活性物質進行提取，利用高效液相色譜法（HPLC）檢測菊花中黃芩苷及綠原酸的含量，進一步將各個時間點的溶出含量繪制成曲線，通過比較分析得出菊花的最優煎煮時間，得出菊花的溶出規律，為菊花科學使用提供實驗參考依據。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Waters e2695D alliance液相色譜儀；AB135-S型分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；Waters 1525 二元梯度泵；KQ5200B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；

1.2 試劑

綠原酸對照品購自中國食品藥品檢定研究院（批號為110753-200413），菊花購于浙江中醫藥大學飲片廠；乙腈（色譜純，美國TEDIA有限公司）；磷酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；去離子水（18.2MΩ）

2 實驗方法

2.1 色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱：Hypersil BOS C18 色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈（A）︰0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫，0～55min（90%～75%），55～75min（75%～60%），75～76min（60%～90%）；檢測器：紫外-可見光檢測器；檢測波長（λ）：210nm；

柱溫：25℃，流速：1mL/min；結果表明，在此色譜條件下，樣品分離效果好，其它成分對綠原酸和黃芩苷的測定無干擾，理論塔板數按綠原酸和黃芩苷計，均不低于3000。

2.2 對照品溶液的制備：

精密稱取綠原酸對照品3.2mg，精密稱取黃芩苷對照品2.06mg，分別置于2mL棕色容量瓶，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品一級母液；取綠原酸一級母液1mL（以及黃芩苷一級母液1mL），于10mL容量瓶，甲醇稀釋至刻度，既得對照品混合母液，置于冰箱保存備用。臨用前將對照品混合母液按不同比例稀釋（稀釋1、2、4、8、16、32倍），得到綠原酸質量濃度為160?g/mL、80?g/mL、40?g/mL、20?g/mL、10?g/mL、5?g/mL，及黃芩苷質量濃度為103.00?g/mL、51.50?g/mL、25.75?g/mL、12.88?g/mL、6.49?g/mL、3.24?g/mL的系列對照品溶液，過0.45?m微孔濾膜，收集續濾液于液相進樣瓶中待進樣。

2.3 供試品溶液的制備：

稱取3g不同產地菊花樣品，分別置于1000mL燒杯，各加入400mL蒸餾水，加蓋，電爐加熱（先武火至沸，后用文火保持微沸），沸騰后立即取樣（記為0min），分別于0min，1min，2min，3min，5min，10min，15min，20min，30min，40min各取樣一次。每次取樣1mL，同時向燒杯中補入1mL等量開水并記錄湯液量。樣品溶液過0.45?m微孔濾膜，取續濾液，即得供試品溶液。

3 實驗結果及方法學考察

3.1 實驗結果

根據上述的操作步驟，得到菊花綠原酸和黃芩苷色譜圖。下圖1為標準樣品色譜圖，圖2為各個供試品菊花水煎液的色譜圖。

圖1 標準品色譜圖

1 綠原酸 2 黃芩苷

圖2 單煎（20min樣品）A 貢菊 B 滁菊 C 杭白菊

1 綠原酸 2黃芩苷

3.2 線性關系試驗：

精密吸取對照品溶液，按上述“2.1”項下色譜條件進行測定，每次進樣10?L，重復3次，以峰面積Y為縱坐標，進樣量（?g）X為橫坐標，進行線性回歸制作標準曲線。綠原酸和黃芩苷標準曲線分別為綠原酸Y=1359135X-1637，r=0.9999；黃芩苷：Y=618223X-14986，r=0.9997。結果表明，2種成分在各自濃度范圍內線性關系良好。

3.3精密度試驗

精密吸對照品溶液，按上述色譜條件，連續進樣6次，每次10μl，測定峰面積。綠原酸的平均峰面積為269452.50，RSD=0.63 %，黃芩苷的平均峰面積為64543.67，RSD=0.46%，結果表明儀器精密度良好。

3.4 穩定性試驗

取新制備的供試品溶液（以貢菊為例），分別在于0h、2h、4h、8h、12h、24h進樣，每次進樣10?L，測定峰面積，計算RSD。綠原酸的平均峰面積為464834.67，RSD=0.52%，黃芩苷的平均峰面積為192104.33，RSD=0.12 %，結果表明供試品在24小時內穩定。

3.5 重復性試驗：

稱取同一批次菊花（以貢菊為例）3g六份，在同一火候、加水量、煎煮方法及取樣時間（10min）制備供試品溶液，在上述色譜條件下進行測定，每次進樣10?L，平行進樣3次，測定峰面積。計算綠原酸RSD=1.41%，黃芩苷RSD=1.34 %，結果表明本測定方法具有良好的重復性。

3.6 三批樣品含量測定

取3種菊花，按供試品溶液的制備方法，每批制備3組。按上述色譜條件，分別進樣10 μl，測定峰面積，計算含量（圖3，4所示）。

圖3 3種菊花中綠原酸含量

圖4 3種菊花中黃芩苷含量

4 結論

本法采用HPLC法測定菊花中2種成分的溶出規律，對樣品靈敏度高，分離效果好，重現性強，操作簡便在210nm下可以較好地檢測到綠原酸和黃芩苷，與其他成分均達到基線分離，符合含量測定的要求。不同產地的菊花其綠原酸和黃芩苷含量有所不同，實驗表明滁菊中綠原酸含量最高，貢菊次之，杭白菊最少，貢菊中黃芩苷含量最高，滁菊次之，杭白菊最少，說明產地能影響其化合物的含量。綠原酸溶出規律為貢菊在5min時已達到最高的溶出，而滁菊和杭白菊分別在15min時溶出最多。黃芩苷的溶出規律為貢菊在4min時溶出最多，而后緩慢下降，而滁菊和杭白菊上升較為緩慢在15min時達到溶出最大值。

5討論

5.1檢測波長和流動相的選擇

由綠原酸，黃芩苷對照品的紫外吸收光譜可知，綠原酸在328nm處有最大吸收，黃芩苷在278nm處有最大吸收，所以選擇波長為210nm處檢測。綠原酸為苯丙酸類化合物，黃芩苷為黃酮類化合物，流動相的酸性和極性對二者影響有較大差異。對比二者結構，控制流動相為弱酸性可抑制其解離，同時可改善峰形。

5.2 與其他色譜法的比較

利用薄層掃描方法來檢測菊花中有效成分含量，不能有效的檢測其含量，利用靈敏度更高的HPLC分析方法能得出不同產地的菊花其含量有所差別。

參考文獻：

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