雷州黑鴨PID1基因部分序列的克隆與蛋白功能分析

黃漢光 湯綺明 蘇瑛 許沖 崔紅艷 常羽 黃駿騰

摘要 [目的]了解雷州黑鴨磷酸酪氨酸互作結構域1（phosphotyrosine interaction domain containing 1，PID 1）基因的序列結構特征及其蛋白的功能，為利用其改善雷州黑鴨肉品質與提高肉風味提供分子理論依據。[方法]采用RTPCR方法克隆雷州黑鴨PID1基因部分序列，測序后比對其同源性，構建系統發育樹，并預測其蛋白結構與功能。[結果]該核苷酸序列長度為369 bp，編碼80個氨基酸，且大多為疏水性氨基酸。與人、牛、雞等物種進行同源性比對，發現雷州黑鴨PID1基因序列與雞具有高度同源性，同源性高達94%，且雷州黑鴨與雞聚于同一系統發育支。蛋白質結構預測表明，該蛋白無跨膜結構與信號肽，氨基酸序列呈疏水性，位于細胞質中。[結論]雷州黑鴨的PID1基因與雞的親緣關系最近，其蛋白主要功能是在細胞質中參與肌內脂肪沉積的調控。

關鍵詞 雷州黑鴨；PID1；克?。坏鞍坠δ芊治?/p>

中圖分類號 S834+.89 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）34-207-04

肌內脂肪（IMF）是衡量鴨肉品質的重要指標之一，與肉的口感嫩度、咀嚼性能及多汁性等密切相關[1]，適量的肌內脂肪不僅改善肉的風味，也提高了消費者的感官滿意度。肌外膜、肌內膜及肌束膜是肌內脂肪的主要儲存場所。研究表明，一方面，肌內脂肪主要通過溶解肌纖維束的作用來提高肉品質的多汁性與口感嫩度，另一方面，磷脂是肌內脂肪的主要組成成分，占20%～50%，磷脂通過增加脂肪酸的降解產物，進而提高肉香味相關化合物的含量，從而改善肉的香味[1-2]。磷酸酪氨酸互作結構域 1（Phosphotyrosine interaction domain containing 1，PID1）是利用抑制性消減雜交技術從正常人群與肥胖人群腹部脂肪組織中檢測到的差異性表達基因，提交 NCBI 后，根據該基因的結構特征被國際統一命名為PID1基因[1，3]。脂肪沉積能力是衡量動物經濟價值的重要參數之一，對脂肪沉積相關候選基因進行研究，可為畜禽品種選育提供參考依據，進而加速育種進程。研究表明，PID1基因通過促進更多的3T3L1脂肪前體細胞進入染色質合成期，進而發揮促進脂肪細胞增殖的作用[3-4]。此外，PID1基因的過表達對胰島素受體底物1（insulin receptor sustrate family 1，IRS1）的酪氨酸磷酸化進程具有抑制作用，降低機體對胰島素的敏感性，進而影響脂肪代謝[5]。錢源等[6]對萊蕪豬PID1基因CDS區進行克隆、表達，并對該基因進行功能性分析，結果表明，PID1基因與萊蕪豬的肌內脂肪沉積有關。殷捷等[7]采用RTPCR方法測定了PID1基因在安徽白山羊不同組織的表達情況，并分析PID1基因與白山羊肌內脂肪的相關性，結果表明PID1基因與安徽白山羊的肌內脂肪沉積量顯著相關。目前人類、大鼠、牛、豬、雞的PID1基因的CDS 序列已經被克隆，但鴨PID1基因序列的克隆與蛋白功能分析未見報道，此外，鴨肌內脂肪沉積的主效基因尚未確定[8]。筆者根據 GenBank登錄的雞PID1基因序列并參考文獻設計引物，擴增出長度為 369bp雷州黑鴨的PID1基因CDS序列，并對其蛋白結構進行功能性分析，為研究雷州黑鴨肌內脂肪代謝調控機理提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

300 d雷州黑鴨種公鴨1只，頸靜脈放血，取胸肌，置于液氮中進行速凍，-80 ℃保存備用。

1.2 試劑與設備

DEPC、RNAiso Regent、Master Mix（2x）、Gel Extraction Kit、pUCT simple vector、OneLysePlasmid Mini Kit均購自北京康為世紀生物科技有限公司；PrimeScriptⅡ1st strand cDNA synthesis Kit購自寶生物工程（大連）有限公司；LB固體培養基、LB液體培養基、緩沖液1×TSS、50 μg/ml Amp/LB固體培養基、50 μg/ml Amp/LB液體培養基均按照要求配制。

1.3 試驗方法

1.3.1 引物的設計與合成。

根據GenBank登錄的雞PID1基因序列（登錄號為NM_001178144.1）分別設計出兩對引物并標記為P1、P2（表1），引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。

表1 引物序列

引物上游（5′3′）下游（5′3′）

P1GCAGCACTTTCAGACCATATTTCCAGAAGAGCATTAGC

P2ACGCTTGCCAGGGAGGATATGTGGTCAGCAGTGCAGTAGG

1.3.2 cDNA片段的制備。

取胸肌50 mg，添加液氮進行研磨后，用Trizol提取總RNA。用Eppendorf BioPhotometer plus檢測其濃度和純度。然后使用PrimeScriptⅡ1st strand cDNA synthesis Kit試劑盒，參見試劑盒說明書合成cDNA。

1.3.3 目的片斷的擴增。

擴增體系（50 μl）：cDNA溶液2.0 μl，上游引物（10 μmol/L）2.0 μl，下游引物（10 μmol/L）2.0 μl，Master Mix（2x）25 μl，dH2O 19 μl。擴增參數：預變性94 ℃ 2 min；變性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min 10 s（30個循環）；延伸72 ℃ 2 min；25 ℃保存產物。

1.3.4

產物回收與測序。采用1%的瓊脂糖凝膠對產物進行電泳，后用Gel Extraction Kit試劑盒對目的片段進行回收，-20 ℃保存備用。

用pUCT simple與回收的目的片段連接，產物轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑選陽性重組子，搖菌，用OneLysePlasmid Mimi Kit試劑盒抽取質粒，送至上海美吉生物醫藥科技有限公司測序。

1.3.5 序列分析與蛋白質結構、功能預測。

所得序列經測序后用NCBI進行比對，證明所得序列為雷州黑鴨PID1基因CDS區，后將該序列翻譯成蛋白質，利用NCBI和DNAMAN的BLAST分析軟件分析所獲得的核苷酸序列和推導氨基酸序列的同源性并構建系統進化樹。使用ExPASy服務的各種在線軟件對該蛋白質序列的結構與功能進行預測。

2 結果與分析

2.1 雷州黑鴨PID1基因的序列分析

測序結果顯示，所得雷州黑鴨PID1基因核苷酸序列長度為367 bp，與預期相同。該核苷酸序列與雞PID1基因（NM_001178144.1）54～422 bp區段具有較高相似度，于574～953 bp處有一個完整的開放閱讀框，具有分析意義。該片段堿基G、C、A、T分別占23.4%、26.4%、26.4%、23.7%，四者所占比例相近，A+T的含量（50.1%）略高于C+G的含量（49.8%）。該序列共編碼80個氨基酸。

2.2 雷州黑鴨PID1基因的序列同源性比較及系統發育進化分析

用BLAST在線軟件對雷州黑鴨與其余物種的PID1基因進行同源性分析，結果顯示同類型物種具有較高同源性，雷州黑鴨與雞的PID1基因同源性高達94%?；贙imura雙參數遺傳模型，利用MEGA 4.1軟件構建PID1基因系統發育樹。人、大猩猩、綿羊、牦牛、牛、豬、鼠、褐家鼠聚在一支，雷州黑鴨與雞聚于同一支，而斑馬魚則單獨成一支（圖1）。

2.3 雷州黑鴨PID1基因的蛋白質結構與功能預測

2.3.1 疏水性分析。

使用ExPASy的ProtScale程序Kyte[9]和Doolittle構建疏水性圖譜并計算蛋白質疏水性GRAVY值。結果顯示，氨基酸序列的兩端呈親水性，疏水氨基酸比例較高，且親水性氨基酸與疏水性氨基酸交替出現（圖2）。

2.3.2 跨膜結構分析。用TMPRED軟件預測分析雷州黑鴨PID1蛋白分子的跨膜結構。TMPRED分析結果顯示PID1不存在跨膜蛋白結構（圖3）。

2.3.3 信號肽的預測。

采用ExPASy Proteomics Server中的SignalP 4.0 Serverprediction軟件分析表明，PID1蛋白序列不存在蛋白質信號肽（圖4）。

2.3.4 蛋白質二級結構的預測。用HNN軟件預測雷州黑鴨PID1蛋白的二級結構，結果顯示存在隨機卷曲、延伸結構和alpha螺旋3種二級結構（圖5），延伸結構、alpha螺旋及隨機卷曲分別占30.0%、11.25%及58.75%。

3 討論

3.1 雷州黑鴨PID1部分堿基序列分析

研究結果顯示，PID1基因核苷酸序列因物種不同而存在差異性，親緣度高的物種，核苷酸序列相似度越高。BLAST對比分析發現，人、大猩猩、綿羊、牦牛、牛、豬、鼠、褐家鼠聚在一支；雷州黑鴨與雞聚于同一支，且同源性高達94%[9-10]；而斑馬魚則單獨成一支。這表明，PID1基因在同物種間具有種屬相似性和生物多樣性，同時不同物種間具有差異性。相近的序列與蛋白結構，其發揮的功能往往相類似[11]。骨骼肌特異性鈣蛋白酶（Muscle specific calpain，p94）被廣泛應用于研究肉的嫩度[12-13]。雷州黑鴨與雞p94基因同源性達90%以

上，且兩者所表達蛋白質結構非常相近，推測雷州黑鴨p94蛋白同樣參與肌肉嫩度的調節功能[11]。研究表明，PID1與動物肌內脂肪沉積密切相關[7，14]。推測由于雷州黑鴨與雞PID1基因同源性高，且雷州黑鴨PID1基因存在一定的自身特異性，是導致雷州黑鴨肉質鮮香，肌肉嫩，良好風味，成為廣受歡迎的肉產品[15-16]的根本原因。

3.2 雷州黑鴨PID1氨基酸序列疏水性分析

利用雷州黑鴨PID1基因氨基酸序列構建的疏水性圖譜，可以看出雷州黑鴨PID1基因氨基酸序列中疏水性氨基酸比例較高，且均勻分布于整個肽鏈中。錢源等[2，6]對萊蕪豬PID1基因進行克隆、表達并研究其與肌肉內脂肪沉積關系，結果顯示豬PID1氨基酸序列整體表現為親水性。疏水性氨基酸可穩定蛋白質的內部構象，而親水性則增加了蛋白質的溶解性。因此，雷州黑鴨PID1基因編碼的疏水性蛋白質比豬的PID1蛋白結構更穩定。

43卷34期 黃漢光等 雷州黑鴨PID1基因部分序列的克隆與蛋白功能分析

3.3 雷州黑鴨PID1蛋白的結構比較與功能分析

SignalP 4.0 Server-prediction軟件分析表明，雷州黑鴨PID1蛋白序列不存在蛋白質信號肽。TMPRED軟件預測分析雷州黑鴨PID1蛋白分子的跨膜結構，結果表明，PID1不存在跨膜蛋白結構。推測雷州黑鴨PID1前體蛋白于胞質合成后，前體蛋白直接在胞質內加工成成熟蛋白質，進而發揮其生物學功能。這和錢源等[6]在豬PID1基因CDS區的克隆、表達及其mRNA表達與肌內脂肪沉積關系的研究中的研究結果豬的PID1蛋白為細胞質蛋白是一致的。

蛋白質二級結構預測結果顯示，隨機卷曲占雷州黑鴨PID1蛋白結構的58.75%。而錢源等[2，6]研究結果表明，豬PID1蛋白質結構以alpha螺旋為主。這可能與動物進化過程中對生存環境及養殖模式的適應性演變有關。

雷州黑鴨的PID1基因與雞的親緣關系最近，其蛋白主要功能是在細胞質中參與肌內脂肪沉積的調控。

參考文獻

[1] 楊倫，徐正剛，王惠，等.RNA干擾沉默PID1基因在C2C12細胞中表達的研究[J].山東大學學報（理學版），2013，48（1）：36-42.

[2] 錢源，曾勇慶，崔景香，等.萊蕪豬PID1基因的功能分析及表達譜研究[J].畜牧獸醫學報，2011，42（5）：621-628.

[3] 余章斌，郭錫熔.肥胖相關新基因NYGGF4的系列研究[J].中華實用兒科臨床雜志，2012，27（1）：53-56.

[4] ZHAO Y P，ZHANG C M，ZHU C，et al.NYGGF4 homologous gene expression in 3T3-L1 adipocytes：Regulation by FFA and adipokines[J].Molecular biology reports，2010，37（7）：3291-3296.

[5] ZENG X Q，ZHANG C M，TONG M L，et al.Knockdown of NYGGF4 increases glucose transport in C2C12 mice skeletal myocytes by activation IRS1/PI3K/AKT insulin pathway.[J].Journal of bioenergetics & biomembranes，2012，44（3）：351-355.

[6] 錢源，曾勇慶，杜金芳，等.豬PID1基因CDS區的克隆及其mRNA表達與肌內脂肪沉積關系[J].遺傳，2010，32（11）：1153-1158.

[7] 殷捷，凌英會，丁建平，等.山羊PID1基因組織表達譜及其與肌內脂肪含量的相關性[J].江蘇農業學報，2014，30（4）：784-789.

[8] 陳小玲，黃志清，賈剛，等.磷酸酪氨酸互作結構域1基因對肉質性狀的調控[J].動物營養學報，2012，24（4）：591-594.

[9] 滿朝來，趙丹丹，李響.雞NYGGF4同源基因的克隆與表達分析[J].中國農學通報，2010，26（4）：1-5.

[10] MAN C L，LI X，ZHAO D D.Cloning，sequence identification，and tissue expression analysis of novel chicken NYGGF4 gene[J].Mol Cell Biochem，2011，346（1/2）：117-124.

[11] 湯綺明，蘇瑛，張麗，等.雷州黑鴨p94部分序列的克隆與蛋白功能分析[J].廣東農業科學，2013（1）：147-153.

[12] ILIAN M A，BEKHIT A D，STEVENSON B J，et al.Up-and down-regulation of longissimus tenderness parallels enhances in the myofibril-bound calpain 3 protein[J].Meat Sci，2004，67（3）：433-445.

[13] JIA Z，PETROUNEVITCH V，WONG A，et al.Mutations in calpain 3 associated with limb girdle muscular dystrophy：Analysisi by molecular modeling and by mutation in mcalpain[J].Biophys J，2001，80（6）：2590-2596.

[14] 徐正剛，楊倫，曾勇慶，等.RNA干擾沉默PID1基因肉兔模型的構建[J].畜牧獸醫學報，2014，45（5）：750-756.

[15] 黃駿騰，蘇瑛，廖院華，等.雷州黑鴨灘涂生活習性觀察[J].南方農業學報，2014，45（3）：484-488.

[16] 湯綺明，蘇瑛，譚道杰，等.雷州黑鴨外貌特征及體型性狀的主成分分析[J].中國家禽，2012，34（19）：20-24.