免疫佐劑研究進展

高明 邵軍軍 ?；菔| 張永光

摘要 佐劑是能夠增強免疫應答或改變免疫應答類型的物質，本身可以具有免疫原性，也可以沒有免疫原性。佐劑種類很多，如氫氧化鋁佐劑、細菌佐劑、脂多糖、細胞因子等。綜述了氫氧化鋁佐劑、多糖佐劑、細胞因子佐劑以及一些新型佐劑的研究進展，旨在為今后開展疫苗和佐劑的相關研究提供參考。

關鍵詞 疫苗；免疫佐劑；研究進展

中圖分類號 R392 文獻標識碼A 文章編號 0517-6611（2015）34-204-03

佐劑是非特異性免疫增強劑，主要作用是提升機體免疫系統對抗原或免疫原的免疫應答反應，或改變免疫應答類型。早期關于佐劑的報道可以追溯到19世紀20年代，研究人員發現在疫苗中加入瓊脂和金屬鹽等物質可以提高抗原的特異性免疫應答。迄今為止，佐劑已廣泛應用于人類和獸疫苗。筆者綜述了氫氧化鋁佐劑、多糖佐劑、細胞因子佐劑以及一些新型佐劑的研究進展，旨在為今后開展疫苗和佐劑的相關研究提供參考。

1 傳統免疫佐劑

1.1 鋁鹽佐劑

自1926年被Glenny發現以來，鋁鹽佐劑一直受到廣泛關注。溶液中的蛋白質抗原通過靜電引力、疏水作用力以及磷酸鹽配體間的交換力等作用力吸附于含鋁疫苗并形成沉淀，抗原的吸附強度直接影響免疫反應。為了研究含鋁疫苗吸附

抗原的能力，Jully V等[1]創建了一個快速的、可重復利用的高通量篩查平臺（HTS），既能使抗原吸附能力被快速定量，又減輕了操作人員的工作量，同時減少試劑的使用。鋁鹽佐劑包括氫氧化鋁凝膠、磷酸鋁和明礬。Ljutic B等[2]將3種肺炎球菌蛋白抗原（PhtD、PcpA、PlyD1）配合鋁鹽佐劑制成疫苗，研究該疫苗的免疫原性、穩定性和吸附性能。免疫BALB/c小鼠，結果表明使用氫氧化鋁佐劑的疫苗誘導的免疫應答反應顯著高于使用磷酸鋁佐劑或無佐劑情況下的免疫反應。利用反相高效液相色譜法RPHPLC測定PcpA和PlyD1的穩定性和小鼠體內抗原的免疫原性，對氫氧化鋁和磷酸根離子進行預處理，減小對抗原的吸附強度以及降低微環境的pH，均能提高抗原的穩定性?？偠灾?，鋁鹽的種類、吸附強度的大小和微環境的pH均對疫苗的免疫原性和化學穩定性有顯著影響。明礬不僅可以增強抗原的免疫原性，而且能誘導Th2型免疫應答。Miki H等[3]已證實磷脂酰絲氨酸（PS）的抑制性受體CD300a在明礬誘導的Th2型免疫反應中起主導作用。

鋁鹽佐劑的缺陷在于不耐低溫也不易保存，而且在與高純度的小分子蛋白抗原共同使用時不能產生足夠的抗體應答，因此并不能滿足新型佐劑的需求，但可以與新型佐劑合用。研究表明，將鋁鹽佐劑和CpG ODN佐劑聯合成的雙佐劑可以提高乙肝疫苗的免疫效果。CpG ODN具有平衡 Th1/Th2 型免疫應答等優點，但CpG ODN進入體內會被快速代謝，若與鋁佐劑協同使用，通過鋁佐劑的作用在體內形成 CpG ODN 庫，便可延長其體內代謝周期。另外有研究表明，若鋁元素在體內累積到一定水平，尤其對于腎功能低下的機體，則會對腦和骨組織產生不良影響，導致神經系統綜合癥。

1.2 油乳佐劑

繼鋁鹽佐劑之后，應用最廣泛的佐劑則為“油包水”的乳狀液，即油乳佐劑。1935年，美籍匈牙利細菌學家Freund發現了弗氏佐劑，也是礦物油佐劑中最經典的一種，分為弗氏不完全佐劑（IFA）與弗氏完全佐劑（CFA）2種。礦物油佐劑黏稠且不穩定，毒副作用大，逐漸被易于代謝的角鯊烯代替。角鯊烯是一種脂質不皂化物，無毒性，最初是從鯊魚的肝油中發現的，又稱魚肝油萜，具有提高

體內超氧化物歧化酶（SOD）活性、增強機體免疫能力等多種生理功能。

MF59是以角鯊烯為油相、以Tween 80和Span 85為表面活性劑的O/W納米油乳佐劑，也是繼鋁鹽佐劑之后唯一被批準的人用佐劑。Lofano G等[4]最新研究發現，MF59能夠促進生發中心B淋巴細胞的分化，誘導持久性免疫應答反應。Montanide ISA720也是典型的以角鯊烯為油相的佐劑，以甘露醇單油酸脂為乳化劑，屬于O/W型乳劑，已經被廣泛用于HIV疫苗和瘧疾疫苗的研發。據報道，Montanide ISA720被乳化后會減少抗原的免疫原性。Xue X 等[5]用試驗推翻了這一結論，新建立了一種ELISA雙抗體夾心法評估重組惡性瘧疾疫苗PfCP-2.9的穩定性和免疫效力，結果表明PfCP-2.9配合ISA720佐劑在4 ℃環境中可以保持蛋白完整性長達18個月之久。

2 多糖佐劑

2.1 菊粉佐劑 菊粉是一類天然果聚糖的混合物，在自然界中分布十分廣泛。Advax是新型的三角洲菊粉佐劑，在安全性和耐藥性方面都優于鋁佐劑和油乳佐劑。Advax可誘導Th1型（IgG2a）和Th2型（IgG1、IgA）抗體反應，并促使產生Th1型（IL2、IFN-γ）和Th2型（IL5、IL6）細胞因子，這也彌補了鋁佐劑的局限性。Gordon等[6]將Advax配合乙肝表面抗原（HBsAg）進行臨床試驗，結果表明Advax可以增強乙肝表面抗體滴度和CD4+T細胞的增殖能力。研究表明，Advax可以結合單核細胞和樹突狀細胞，促進抗原特異性T細胞和B細胞的活化。應用于甲型H1N1流感疫苗時，Advax能夠提高重組血凝素蛋白的免疫原性，有效預防該病的大流行。

2.2 殼聚糖佐劑

殼聚糖又稱脫乙酰甲殼素，是由幾丁質經過脫乙酰作用而得到的。自1859年法國人Rouget首先得到殼聚糖以來，這種天然高分子的生物官能性、相容性、微生物降解性等優良性能被人們廣泛關注。殼聚糖可以刺激促炎性細胞釋放細胞因子IL1β、IL6、TNFα、MCP1和 MIP1α，促進 CD4+和 CD8+T 細胞的增殖，誘導體液免疫和細胞免疫應答。殼聚糖

在抗腫瘤方面也有顯著效果。殼聚糖可以誘導來源于小鼠骨髓的單核細胞分化為樹突狀細胞，給小鼠接種由殼聚糖培養基培養的腫瘤抗原致敏的樹突狀細胞，可以增強細胞毒型T細胞的活動來對抗腫瘤。Highton等[7]應用包含殼聚糖水凝膠、OVA抗原的疫苗免疫小鼠，結果表明殼聚糖通過刺激OVA特異性CD8+T細胞記憶反應，保護小鼠應對黑色素瘤的挑戰。

2.3 葡聚糖佐劑

β葡聚糖是細菌、真菌和植物中存量最多的多糖，如酵母多糖、香菇多糖和藻多糖。據報道，β葡聚糖有抗腫瘤作用，可提高疫苗的免疫應答。將β葡聚糖與重組甘油醛磷酸脫氫酶疫苗免疫動物，機體產生了高水平的抗體，并顯著上調了參與免疫反應的調節分子的轉錄水平。Wang M等[8]從釀酒酵母提取的硫酸葡聚糖可誘導雞脾淋巴細胞在體外增殖，當將硫酸葡聚糖和紐卡斯爾病疫苗一起注射到雞體內，硫酸葡聚糖增強血清抗體滴度以及提高血清IL2和IFNγ的濃度。試驗還表明，HBsAg配合硫酸多糖的試驗組IgG2a/IgG1的比值顯著高于HBsAg配合鋁佐劑的試驗組。除了β葡聚糖以外，一些α葡聚糖也具有免疫調節功能，如Nano11[9]。Nano11是一個樹枝狀αD葡聚糖納米顆粒，可以通過靜電作用吸附帶負電的蛋白抗原。作為抗原載體，Nano11可以增強樹突狀細胞攝取抗原的能力，并在體外激活樹突狀細胞。此外，肌肉注射Nano11可以顯著增加抗原的免疫效應，不僅可以增加抗體效價，而且還能在注射部位聚集大量的單核細胞。

2.4 其他多糖佐劑

甘露聚糖作為免疫佐劑，在先天性免疫中扮演著重要的角色。疫苗和甘露聚糖蛋白結合可以保護小鼠抵抗全身曲霉病[10]，也可以抵抗癌癥。Vassilaros S等[11]在對12～15歲的乳腺癌患者的跟蹤試驗中發現，使用甘露聚糖MUC1黏蛋白作為免疫佐劑，可以降低癌癥的復發率，且不會引起任何不良反應。

研究發現，低聚果糖（FOS）也具有佐劑效應。將傳染性支氣管疫苗配合FOS免疫機體，證實FOS可以促進產生更多的病毒特異性IgG抗體[12]。脂多糖的衍生物——單磷酰脂質A（MPL）已被證實是一種通過與TLR4受體結合的無毒的免疫佐劑。常用的AS04佐劑由MPL和磷酸鋁佐劑組成，由CSK公司生產，是已經被許可用于乙肝病毒疫苗和人乳頭瘤病毒疫苗的佐劑。近年來，由MPL和QS21兩種佐劑組成的佐劑也被應用于乙肝疫苗。

3 細胞因子免疫佐劑

1983年，Staruch MJ等[13]曾報道細胞因子可以作為疫苗佐劑。迄今為止，研究報道較多的是干擾素（IFN）和白細胞介素（IL）。不同白細胞介素之間具有相互協同或制約的作用，由此構成了錯綜復雜的細胞因子網絡，對免疫起著重要的調節作用。

3.1 干擾素

干擾素的佐劑效應主要體現在抗腫瘤方面。Fabian Wolpert等[14]研究發現IFNβ可以作為應用免疫療法靶向治療膠質母細胞瘤的佐劑，增強免疫反應。樹突狀細胞利用不同細胞亞群的獨特屬性來治療腫瘤是一種新的方法，該方法的關鍵在于TLR3可以誘導分泌IFNα，進而由IFNα迅速誘導TLR7的表達，引發強烈的TH1型免疫應答[15]。

3.2 白細胞介素

3.2.1 白細胞介素1（IL1）。

IL1主要由單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和上皮細胞產生，具有廣泛的免疫調節作用，可以促進胸腺細胞和T細胞的增殖與分化，增強NK細胞的殺傷活性，促進IL2、IL3、IL4、GCSF等多種免疫分子的表達。

3.2.2 白細胞介素2（IL2）。

IL2必須與IL2受體（IL2R）結合才能發揮生物學效應[16]。與傳統疫苗佐劑（如鋁佐劑）相比，IL2一次少量接種即可在宿主體內長時間低量表達，且對人體本身無毒副作用。

3.2.3 白細胞介素6（IL6）。

IL6是細胞因子網絡中的關鍵成分，不僅影響B細胞和T細胞的增生與分化，而且參與CTL分化及對顆粒細胞和巨噬細胞的作用。Su L K等[17]研究表明IL6可作為佐劑顯著提高防齲DNA疫苗的免疫原性。

3.2.4 白細胞介素12（IL12）。

IL12的最大特點是在極低濃度時就有顯著活性，且其活性高于IL2和IFN。作為佐劑，IL12更多是與其他因子聯合作用。Khan T等[18]研究發現IL12和IL23聯合應用在誘導粘膜免疫應答和降低病毒對肺的負擔方面具有粘膜佐劑的潛力，可顯著降低所需保護疫苗的劑量。

4 新型免疫佐劑

4.1 免疫刺激復合物及基質

免疫刺激復合物（ISCOM）是由抗原物質與糖苷QuilA及膽固醇按1∶1∶1混合后自發形成的一種具有較高免疫活性的脂質小泡，主要適用于提高亞單位疫苗的免疫原性，還能有效通過黏膜給藥，從而提高黏膜免疫功能，用于抗呼吸道感染。Camussone CM等[19]分別以金黃色葡萄球菌和裂解細胞作為免疫原配合ISCOM免疫懷孕的母牛，二者均刺激機體產生了強烈的體液免疫應答，并在牛奶和血液中獲得了高水平的抗體。與菌苗配方相比，裂解液配方產生了更高、更持久的抗體滴度。

與ISCOM不同，ISCOM基質（ISCOMmatrix）既不包含抗原，又具備QuilA額外的佐劑效應和微粒載體系統2個優點，同樣可作為良好的佐劑。一直以來，預防豬支原體肺炎的疫苗都是胸腔注射，以達到對機體的最佳保護，但這種方式大大限制了疫苗的使用。為改善胸腔注射的局限性，Xiong Q等[20]嘗試肌肉注射，由于以前的研究表明肌肉注射誘導的免疫反應對試驗感染的保護性不足，因此利用QuilA、磷脂和膽固醇制成顆粒佐劑，即ISCOMmatrix。結果表明，機體產生了較強的免疫應答，且ISCOMmatrix無毒副作用。

4.2 卡介苗 （ BCG）

BCG可促進DCs的同型黏附作用，能刺激骨髓的多功能干細胞發育成免疫活性細胞，從而明顯提高機體的免疫力。最近的一些研究表明，BCG增強免疫反應需要依賴某些中間介質。Jinesh GG等[21]發現TNFα是BCG刺激中性粒細胞分泌的重要介質。Kleinnijenhuis J等[22]證實NK細胞有利于促進接種卡介苗后產生的非特異性免疫，并增加促炎細胞因子的產生。此外，在研究散播性念珠菌病的小鼠模型中已經證實接種卡介苗后依賴NK細胞可以提高小鼠的存活率。 Iljine DA等[23]研究發現卡介苗可以促進粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的分泌，促使TNFα基因轉錄和 TNFα蛋白的釋放，還可以增強巨噬細胞無絲分裂早期的活動，但若將其大量應用會引起嚴重的副作用。Liu Q等[24]研究發現經BCG活化的巨噬細胞可產生一個新的分子，命名為NMAAP1。NMAAP1在巨噬細胞中過度表達會導致M1型巨噬細胞極化，并提高M1型基因的表達水平，調節巨噬細胞的表型，增強巨噬細胞的吞噬能力。

4.3 寡脫氧核苷酸（CpG ODN）

研究表明，CpG ODN 能夠活化B細胞，提高B細胞表面抗原遞呈相關分子的表達，而對T細胞無明顯作用。Behrens NE等[25]研究發現CpG ODN可以顯著促進調節性T細胞的分化。CpG ODN的免疫刺激作用與激活TLR9有關[26]，TLR9分布于細胞的內質網膜上，能識別非甲基化的CpG二核苷酸，從而能有效識別入侵的病原體核酸。CpG ODN能直接激活樹突狀細胞和抗原遞呈細胞等，間接激活NK細胞，誘導以Th1型為主的免疫應答。Gunawardana T等[27]已經證實單純的CpG ODN在雛雞卵內遞送系統中可以顯著保護新生肉雞抵抗大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌感染。近年來，他們又將CpG ODN與2種類型的碳納米管或紙質表面活性劑混合，檢測其在新生肉雞對抗大腸桿菌敗血癥時的安全性和免疫保護性能。結果表明，使用該混合制劑可以將雛雞的存活率由20%左右提升為80%左右，且與單純使用CpG ODN及生理鹽水對照組相比細菌負荷量也顯著降低。

4.4 納米佐劑

納米佐劑由納米材料構成，其優勢在于吸附能力強、緩釋功能好，具有很好的靶向性和穩定性。從免疫學觀點來看，納米佐劑可以誘導共刺激分子的正向調節以及刺激產生細胞因子，包裹或吸附的抗原顆粒正是巨噬細胞（MФ）和樹突狀細胞（DC）的首選吞噬目標，為實現機體有效的免疫反應完成了重要的一步，特別是細胞免疫。此外，納米佐劑與多肽抗原或DNA疫苗連接后，可以避免常規佐劑載體效應的發生，起到保護抗原的作用。聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）納米佐劑是一個能使生物降解的生物相容性聚合物，Singh D等[28]探索其潛在的免疫原性，將布氏桿菌的免疫顯性抗原蛋白L7和L12包裹于PLGA中，對抗布氏桿菌，初次免疫后即可產生高水平的IgG抗體水平，促進Th1型細胞因子尤其是 IFNγ的分泌。Saeed MI等[29]提出了提高黏膜疫苗免疫力的新方法，即將HEV71疫苗與包裹了殼聚糖和海藻酸鈉載體的納米磷酸鈣佐劑配合，采用雙重免疫（皮膚和黏膜）途徑提升唾液中IgA和全身性IgG的分泌水平，提高了病毒中和抗體效價，能同時誘導黏膜免疫和全身性免疫反應對抗HEV。

5 展望

疫苗是預防疫病的關鍵，而對于疫苗而言，佐劑的選擇顯得尤為重要。合理使用佐劑，不僅可以節約抗原的使用量，而且能迅速刺激免疫系統，增強免疫應答。盡管有很多新型佐劑不斷出現，但研制出更多適用于人類疫苗的佐劑仍是今后努力的重要方向。應該著重建立可靠的非臨床模型，并結合各種佐劑的特點，將不同佐劑聯合使用，進一步調節所需的免疫反應。疫苗不僅用于預防疾病，而且可以用于治病，適用于治療性疫苗的佐劑在未來也具有廣闊的發展前景。

參考文獻

[1]

JULLY V，MONIOTTE N，MATHOT F，et al.Development of a highthroughput screening platform to study the adsorption of antigens onto aluminumcontaining adjuvants [J].J Pharm Sci，2015，104（2）：557-565.

[2] LJUTIC B，OCHS M，MESSHAM B，et al.Formulation，stability and immunogenicity of a trivalent pneumococcal proteinvaccine formulated with aluminumsalt adjuvants [J].Vaccine，2012，30（19）：2981-2988.

[3] MIKI H，NAKAHASHIODA C，SUMIDA T，et al.Involvement of CD300a phosphatidylserine immunoreceptor in aluminum salt adjuvantInduced Th2 responses [J].J Immunol，2015，194（11）：5069-5076.

[4] LOFANO G，MANCINI F，SALVATORE G，et al.Oilinemulsion MF59 increases germinal center B cell differentiation and persistence in response to vaccination[J].J Immunol，2015，195（4）：1617-1627.

[5] XUE X，DING F，ZHANG Q，et al.Stability and potency of the Plasmodium falciparum MSP119/AMA1（III） chimeric vaccine candidate with Montanide ISA720 adjuvant [J].Vaccine，2010，28（18）：3152-3158.

[6] GORDON D，KELLEY P，HEINZEL S，et al .Immunogenicity and safety of AdvaxTM，a novel polysaccharide adjuvant based on delta inulin，when formulated with hepatitis B surface antigen：A randomized controlled Phase 1 study[J].Vaccine，2014，32：6469-6477.

[7] HIGHTON A J，KOJARUNCHITT T，GIRARDIN A，et al.Chitosan hydrogel vaccine generates protective CD8 T cell memory against mouse melanoma[J].Immunol Cell Biol，2015，93（7）：634-640.

[8] WANG M，YANG R，ZHANG L，et al.Sulfated glucan can improve the immune efficacy of Newcastle disease vaccine in chicken[J].Int J Biol Macromol，2014，70：193-198.