超高效液相色譜—質譜法測定豆芽中6曹謝腺嘌呤的方法研究

武婷 薛園園 趙小珍

摘要[目的]建立超高效液相色譜質譜聯用法（UPLCMS/MS）測定豆芽中6芐基腺嘌呤（6BA）的方法。[方法]豆芽樣品經過酸化甲醇提取，高速離心沉淀分離后，采用超高效液相色譜柱WATERS ACQUITY C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）分離，乙腈和0.1%甲酸水溶液進行梯度洗脫。[結果]6BA在1.0～200.0 ng/ml范圍內，線性關系良好，回歸系數R2為0.998 4，回收率達到85.3%～93.0%，精密度達到1.39%～2.75%。[結論]該方法穩定，操作簡便、快速，提取效率高，重現性好，對豆芽樣品中6BA的檢測提供了有力的技術支持，有很高的實用價值。

關鍵詞超高效液相色譜-質譜法；豆芽；6芐基腺嘌呤

中圖分類號S03文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）34-088-02

6芐基腺嘌呤（6Benzylaminopurine，6BA）是一種人工合成的細胞分裂素，是使用非常廣泛的生長調節劑。6BA作為植物促長劑和果蔬保鮮劑的主要成分，已在國內外進入應用階段。目前，6BA的應用已經拓展到果樹栽培和園藝等領域。作為植物促長劑使用，6BA能提高種子發芽率，促進幼苗生長，最終提高產率，常被用于促進豆芽的生長。用6BA配成不同濃度的水劑，對于農作物可起到調節生長的作用，使水稻和黃瓜增產、增收，并使黃豆芽粗壯且無根。據報道，市場上豆芽中6BA添加超標現象嚴重。人體攝入過量的6BA會刺激皮膚黏膜，傷害食道和胃黏膜，出現惡心、嘔吐等現象。而相關的定量檢測方法有常規的紫外分光光度法[1]、液相色譜法[2-7]、液相色譜-質譜法等[8-10]。其中紫外分光光度法檢出限高，不能滿足痕量檢測的要求，而高效液相色譜法靈敏度低、定性能力差、抗干擾能力弱，普通高效液相色譜-質譜法雖然靈敏度較高，但是樣品分離時間較長。筆者建立了超高效液相色譜-質譜聯用法檢測豆芽中6BA的方法，分離時間大大縮短，溶劑消耗量也減小到最低用量，并且具有更高的靈敏度和分離度，對豆芽樣品中6BA的檢測提供了有力的技術支持。

1材料與方法

1.1材料供試豆芽，市購。主要儀器：ACQUITY UPLC XEVO TQ超高效液相色譜質譜聯用儀，美國WATERS公司；PipetLite XLS移液器（Rainin Instrument），LLC a METTLER TOLEDO Company，美國；組織搗碎機（Retsch GM200），德國；高速離心機（TGL16M），湘智離心機。

主要試劑：6BA標準品（純度99.0%），德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈、甲酸、乙酸，均為色譜純；實驗室用水為超純水；酸化甲醇，每100 ml甲醇中加入乙酸50 μl，混勻；6BA 標準溶液，精密稱取6BA標準品0.100 0 g 于100 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，此溶液每毫升相當于1.00 mg 6BA。臨用時用甲醇稀釋至所需的濃度。

1.2色譜條件流動相A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈，具體情況見表1。

色譜柱：WATERS ACQUITY C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；進樣量：10 μl；柱溫：40 ℃。

1.3質譜條件電離模式：ESI+；掃描方式：多反應監測（MRM）；毛細管電壓：3.0 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：450 ℃；錐孔流速：50 L/h；脫溶劑氣流速：900 L/h；碰撞氣流速：0.17 ml/min；母離子：226.1；子離子：91.1（定量離子），148.0；錐孔電壓：35 V；碰撞能量：25 eV，20 eV。

1.4樣品預處理試樣經組織搗碎機搗碎混勻后備用。取5 g樣品（精確至0.01 g）于50 ml聚丙烯離心管中，加入10 ml酸化甲醇，用均質機均質3 min，10 000 r/min離心10 min，上清液轉入50 ml容量瓶中，樣品再用20 ml酸化甲醇重復提取2次。合并上清液，用水定容至刻度，搖勻，吸取2 ml于10 ml容量瓶中，用50%甲醇水溶液定容至刻度，搖勻，經0.2 μm濾膜過濾，供UPLCMS/MS分析。

1.5方法學試驗

1.5.1線性關系。準確稱取5 g（精確至0.01 g）未添加6BA的豆芽勻漿液，準確加入6BA的對照品溶液，使豆芽樣品中6BA的濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng/ml，按照“1.4”方法進行樣品處理，按照色譜、質譜方法進樣，記錄MRM圖，得峰面積。得到線性回歸方程和相關系數。

1.5.2檢出限與定量限。準確稱取5 g（精確至0.01 g）未添加6BA的豆芽勻漿液，準確加入6BA的對照品溶液，使豆芽樣品中6BA的濃度為0.1、0.2、0.5 ng/ml，按照“1.4”方法進行樣品處理，按照色譜、質譜方法進樣。記錄MRM圖中定量離子的信噪比，以3倍信噪比計算得出檢出限，10倍信噪比計算得出定量限。

1.5.3回收率和精密度測定。平行稱取18份5 g（精確至0.01 g）未添加6BA的豆芽勻漿液，準確加入100 μl 10.0、50.0、100.0 ng/ml 6BA的標準品溶液，每個濃度平行6份，使豆芽樣品中6BA的添加量為0.2、1.0、2.0 μg/kg，按照“1.4”方法進行樣品處理，按照色譜、質譜方法進樣，計算每個濃度下的回收率，同時計算相對標準偏差。

2結果與分析

2.1線性關系選用6BA的溶液濃度為1.0～200.0 ng/ml的樣品溶液進樣分析，以峰面積為縱坐標、相應濃度為橫坐標，繪制標準工作曲線，見圖1。得到標準曲線為y=3 327.1x+60 386，r2=0.998 4。線性關系良好，完全符合方法學要求。6BA標準溶液的MRM圖見圖2。

2.2檢出限與定量限對豆芽樣品中6BA的濃度為0.1、0.2、0.5 ng/ml測定所得的MRM圖中的色譜峰進行信噪比計算，濃度為0.1 ng/ml時，信噪比大于3倍空白信噪比，得出檢出限為0.1 ng/ml。濃度為0.2 ng/ml時，信噪比大于10倍空白信噪比，得出定量限為0.2 ng/ml。

2.3回收率與精密度選擇未添加6BA的豆芽作為空白樣品，選擇3個濃度的6BA進行加標回收率試驗，所得結果見表1。豆芽樣品中平均回收率為85.3%～93.0%。根據國家標準GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》中對檢測方法確認的技術要求中，被測組分濃度含量小于0.1 mg/kg時，回收率在60%～120%，符合方法學的要求。計算每個濃度下平行6次的試驗結果，計算相對標準偏差，所得精密度見表1。

2.4實際樣品分析采用所建立的分析方法對市場上隨機抽查的綠豆芽、黃豆芽等豆芽類樣品共10批次進行6BA殘留量的定性、定量分析。結果表明，被測的10批次樣品中，均未檢出6BA。

3結論

該研究建立了豆芽中6BA的超高效液相色譜-質譜聯用的檢測方法。通過線性關系、檢出限與定量限、空白基質中3個濃度的加標回收率和精密度試驗等方法學考查，得出該法結果滿意，完全符合方法學要求。方法簡便、快速、穩定、重現性好，便于推廣使用，對于豆芽中6BA的殘留監控提供了有力的技術支撐。

參考文獻

[1] 吳增茹，李長榮.紫外分光光度法測定6BA的含量[J].中國農業大學學報，1998，3 （3）：87-89.

[2] 趙樹蘭，韓蘊華，喬艷紅，等.豆科植物促長劑中6BA的RPLC研究[J].天津師大學報（自然科學版），1998，18（1）：43-46.

[3] 謝君，張義正.植物內源激素的反相高效液相色譜法測定[J].分析測試學報，2001，20（1）：60-62.

[4] 李小平，陳曉紅，姚潯平，等.HPLC法測定豆芽中6BA殘留研究[J].中國衛生檢驗雜志，2005，15（2）：149-151.