耐低溫灰樹花工廠化生產菌株的篩選

馮芳俠 付慶偉 王鳳春 付慶成

摘要[目的]篩選適合低溫環境生產出菇的菌種。[方法]通過比較13個野生灰樹花菌株的菌絲生長速率、生長勢、拮抗性，并以栽培周期、子實體品質及前期生物學轉化率等為指標進行工廠化栽培考察。[結果]菌株“ZDL05”在（18±2）℃時68 d完成2次出菇，且生物轉化率為82.3%，同時在顏色、風味、葉片厚度、口感及朵形等方面表現優秀，適合灰樹花低溫工廠化栽培。[結論] 灰樹花菌株ZDLM05可以作為秋冬季或較低溫地區工廠化生產菌種。

關鍵詞灰樹花；耐低溫；菌株篩選；工廠化

中圖分類號S646文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）34-056-03

灰樹花[Grifola frrondosa（Dicks.Fr.）S.F.Gray]是擔子菌亞門層菌綱無隔擔子菌亞綱非褶菌目多孔菌科灰樹花屬真菌，為珍貴的藥食兩用菌。其人工栽培歷史較短，受前期生物轉化率低、多糖含量低等因素制約，灰樹花栽培成本較高，工廠化生產技術發展緩慢，制約了整個行業的發展。篩選前期生物轉化率高、適合低溫環境出菇的工廠化栽培菌種，既能滿足秋、冬及初春較低溫度環境下工廠化出菇，又能降低生產成本，可以極大地滿足灰樹花工廠化栽培的需求[1]。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1培養基配方。

基礎培養基：馬鈴薯200.00 g，栗木屑50.00 g，麥麩50.00 g，葡萄糖20.00 g，蛋白胨2.00 g，維生素B1 0.01 g，CaH2PO4 3.00 g，MgSO4 1.50 g，瓊脂粉20.00 g，定容至1 000 ml。

原種、栽培種培養基：栗木屑35%、棉籽皮15%、麩皮15%、玉米芯20%、栗蓬10%、海泡石粉2%、蔗糖1%、過磷酸鈣1%、石膏1%，含水量65%，常壓100 ℃滅菌12 h。

1.1.2菌株及來源。

13個灰樹花菌株系從唐山市遷西縣東荒峪、漢兒莊等地收集、分離純化和篩選獲得的野生菌株。

采用組織分離法，取子實體柄葉結合部位組織接種到基礎培養基平板上，在25℃下恒溫培養形成菌落，采用菌絲尖端純化法純化菌種，并用基礎培養基斜面保存備用，依次編號為ZDLM01～ZDLM13。以當地主栽品種“小黑汀”為對照，由河北省燕山科學試驗站提供。

1.1.3試劑。

木聚糖，Sigma公司；其他試劑如醋酸鈉、酒石酸鉀鈉、丙酮、3，5二硝基水楊酸（DNS）、MgSO4、NaOH等均為國產分析純試劑。

DNS顯色劑（3，5二硝基水楊酸顯色劑）：稱取10 g 3，5二硝基水楊酸溶于蒸餾水中，加入20 g氫氧化鈉、200 g酒石酸鉀鈉和500 ml水，加熱溶解后再加入重蒸酚2 g、無水亞硫酸鈉0.5 g，待全部溶解后，冷卻，蒸餾水定容至1 000 ml，貯于棕色瓶中，放置7 d后使用，用前過濾。

醋酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH 4.6）：稱取NaAC 0.8 g，加入蒸餾水80 ml溶解，用醋酸調pH至4.6，最后用蒸餾水定容至100 ml。

木聚糖溶液（1%）：稱取木聚糖0.501 g，用蒸餾水溶解并定容至50 ml。

濃縮膠緩沖液（0.5 mol/L，pH 6.8）：稱取6.06 g Tris，加80 ml dd H2O溶解，用鹽酸調pH至6.8，最后定容至100 ml。

1.1.4主要儀器。

UV8100紫外可見分光光度計，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；

潔凈工作臺，上海博迅實業有限公司；

梅特勒電子分析天平，河南鄭州南北儀器設備有限公司；

LDZH150KBS型立式蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠。

1.2試驗方法

1.2.1最適發菌溫度試驗。

采用生長速率法進行測定。用基礎培養基做成平板，接種環挑菌種置于平板中央，分別在16、18、20、22、24、26、28、30 ℃下恒溫培養10 d后，測量菌落直徑，每個處理3個平行試驗，結果取平均值。

1.2.2出菇試驗。

以栗木屑35%、棉籽皮15%、玉米芯20%、麩皮15%、栗蓬10%、海泡石粉2%、蔗糖1%、過磷酸鈣1%、石膏1%為配方。將栗木屑、棉籽殼、栗蓬渣等主料稱好，混在一起攪拌均勻，再將麩皮、過磷酸鈣、蔗糖、石膏等輔料隨水拌入料中，料水比為1∶1.2～1∶1.3，含水量65%，常壓100℃滅菌12 h。

以主栽品種“小黑汀”為對照，與13個野生優種各200棒作對比試驗；按照“1.2.1”結果中各菌種最適生長溫度（±2 ℃）為培養溫度，采用層架式發菌，菌絲長滿菌袋后，剝袋置于長×寬×深=2.0 m×0.5 m×0.3 m生長畦內，覆土栽培，出菇兩潮為止。分別記錄2次出菇量、出菇溫度、出菇時間、平均單重，以前期生物轉化率、產量、顏色、氣味、葉片厚度、產量等指標[2-3]，篩選低溫環境下前期生物轉化率、商品性狀較好的野生優種。

1.2.3菌絲生長勢測定。

以主栽品種“小黑汀”為對照，將3個野生優種在基礎培養基活化后，沿菌落的邊緣取直徑5 mm的菌塊，分別接種于PDA加富平板培養基上。每個菌種3個重復，于各自適宜的生長溫度下恒溫培養3 d，每天定時觀察菌落的生長狀況，并精確測量菌落半徑，計算菌絲生長速度。

菌絲生長速度（mm/d）=菌落半徑（mm）/菌絲生長天數（d）

1.2.4木聚糖酶活力測定。

沿菌落邊緣挖取模擬出菇培養基上的菌絲各1 g于試管中，加pH 4.6 0.1 mol/L醋酸鈉緩沖液10 ml，25 ℃浸提過夜（12 h），將浸提液用濾紙過濾，取濾液1 ml加入試管中，然后加入9 ml蒸餾水稀釋，充分混勻，得粗酶液待用。

將pH 4.6醋酸鈉緩沖溶液、1%木聚糖溶液及粗酶液于40 ℃水浴預熱2 min，然后在試管中依次加入pH 4.6醋酸鈉緩沖溶液1 ml，1%木聚糖溶液0.5 ml，稀釋后的粗酶液0.5 ml。40 ℃水浴30 min后，加入DNS 3 ml，100 ℃水浴5 min后水冷，在波長510 nm下測定OD值。酶活力以樣品與底物反應30 min后吸光值的改變表示。

1.2.5拮抗性試驗。

將活化后的供試菌株沿菌落邊緣用打孔器切下直徑5 mm的菌塊，每2個不同菌株的菌塊相距約1 cm，接種于同一基礎培養基平板上，于20 ℃恒溫培養箱內培養7 d，觀察不同菌株間是否有拮抗線的存在，拮抗線是否明顯。

2結果與分析

2.1最適發菌溫度

一般灰樹花菌株菌絲體生長適宜溫度為22～30 ℃，在22 ℃以下或30 ℃ 以上生長緩慢。由表1可知，ZDLM03菌株菌落直徑在28 ℃時最大達到4.9 cm。其中，ZDLM05、ZDLM06、ZDLM12在相對低溫下（18～24 ℃）具有較大的生長量；ZDLM05在此溫度范圍下菌落直徑能達到4.4 mm，有較大的應用空間。

2.2出菇試驗結果

由表2可知，傳統優種“小黑汀”比ZDLM05號優種2次出菇時間長15 d，且后者在較低溫度（18±2）℃下生物轉化率達到82.3%；ZDLM12優種也比“小黑汀”早7 d完成出菇，生物轉化率同比高6.3%。

結合灰樹花子實體的特有香味、灰黑色、葉片厚實等傳統評價指標，優種ZDLM05具有耐低溫（18±2） ℃、前期生物轉化率高（82.3%）及較好的產品特性，符合工廠化生產菌種的特征。

2.3菌絲生長勢

由表3可知，4個灰樹花菌株在PDA加富培養基上的生長速度雖存在一定差異，但不明顯，生長速度排列為ZDLM05>ZDLM12>ZDLM06>小黑汀；ZDLM06灰樹花優種生長勢較旺，有粗壯優勢菌絲發育。

2.4木聚糖酶活力

"小黑汀"、ZDLM05、ZDLM06、ZDLM12灰樹花菌株的木聚糖酶活力分別為13.12±0.11、25.25±0.29、24.67±0.14、19.52±0.06 U，3個篩選的灰樹花菌種均高于對照組；其中ZDLM05菌株的活力最高，接近“小黑汀”的2倍；此結果與菌種的生物轉化率相一致。

2.5 拮抗性

由表4可知，“小黑汀”和3個篩選的灰樹花菌株間拮抗作用明顯，表明考察的3個野生菌種相對獨立，親緣關系較遠。

3結論與討論

我國工廠化灰樹花生產分為液體發酵罐菌絲體發酵生產灰樹花多糖和工廠化栽培生產子實體兩類。第一類主要滿足工業及醫藥生產需求，已經發展相對成熟；第二類主要滿足日益增長的營養食材的需求，產品產量低、成本高，產業發展緩慢，其中前期生物轉化率低、生長周期長是最重要的制約因素。工廠化栽培食用菌通常只采收第一潮菇，以提高菇房利用率，降低生產成本。前期研究表明，灰樹花第二潮出菇量為第一潮出菇量的50%～85%，出菇周期短的灰樹花品種，收兩潮菇可以降低成本40%～78%。

因此，以前期生物轉化率為指標，篩選生產周期短、耐低溫的灰樹花菌種，不僅可以提高單位產量和菇房使用率，還可以降低冬季生產的操作成本和生產風險，實現工廠化生產的利潤最大化。該試驗通過最適生長溫度和小試工廠化生產，只能提供灰樹花優種的篩選依據，不能完全依靠其結果作為菌株篩選的最終標準。該試驗階段獲得ZDLM05、ZDLM06和ZDLM12共3個野生優種，均能在小于或等于22 ℃時正常出菇；其中ZDLM05可以在（18±2）℃時68 d完成2次出菇，且生物轉化率達到82.3%；同時子實體性狀和產品標準較高，是難得的工廠化生產菌種。該研究繼續考察了3個野生優種的生長勢、木聚糖酶活力和拮抗性，以定性或半定量的形式考察了菌種的親緣關系和生物轉化能力，其中ZDLM05不是每項指標均最佳，但綜合評比適宜工廠化栽培。

綜上所述，灰樹花菌株ZDLM05可以作為秋冬季或較低溫地區工廠化生產菌種，能在68 d內完成2次出菇，且生物轉化率達到82.3%，與傳統主栽品種“小黑汀”相比，優勢非常明顯；同時菌株生物穩定性好，可進一步研究其栽培工藝、環境控制參數等條件，保證高產、穩產。

參考文獻

[1] 潘輝，王瑞娟，李正鵬，等.工廠化栽培灰樹花菌株的篩選研究[J].北方園藝，2011（1）：188-191.

[2] 沈高潮，姚庭永，姚松濤，等.灰樹花“小黑汀”的特性及栽培要點[J].食藥用菌，2014，22（1）：59-60.

[3] 陳秀娟.灰樹花工廠化周年栽培技術[J].中國園藝文摘，2012（6）：141-142.