流式細胞學檢測三陰性乳腺癌的生物學意義

張景臣1（通訊作者） 劉 薇1 毛大華2

【摘 要】目的：S期細胞比率（S-Phase Fraction SPF）、倍體表達在三陰性乳腺癌與非三陰性乳腺癌之間有無差別；方法：通過流式細胞儀檢測135例乳腺SPF及倍體表達情況。結果：19例三陰性乳腺癌中SPF：9.32±4.89；116例非三陰性乳腺癌SPF：5.65±4.14；三陰性乳腺癌中二倍體6例、異倍體13例，非三陰性乳腺癌二倍體49例、異倍體67例；結論：三陰性乳腺癌的SPF值較非三陰性乳腺癌差異明顯有統計學意義，而倍體表達無明顯差異無統計學差異；高表達的SPF與年齡、臨床分期有明顯相關性，而與淋巴結有無轉移、腫塊大小無明顯相關性。

【關鍵詞】三陰性乳腺癌；流式細胞學檢測；S期細胞比率 倍體表達

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）及人表皮生長因子受體2（HER-2）均為陰性的乳腺癌亞群。TNBC為預后最差的乳腺癌亞型，具有侵襲性強，惡性程度高、預后差等特點[1]，除化療外尚無有效地全身治療措施，依靠現有的臨床和病理指標難以對三陰性乳腺癌患者進行最優化的個體化治療和預后分析。

受體檢測和陽性判定標準 ER、PR受體采用免疫組織化學法檢測，陽性細胞比例≥1%判定為陽性。HER-2受體采用免疫組化與免疫熒光原位雜交（FISH）相結合的方法進行檢測，陽性判定標準為：①免疫組織化學檢測“+++”定義為陽性，“—”和“+”定義為陰性。②免疫組織化學檢測“++”必須經FISH檢測再次確定：若FISH（fluorescence in situ hybridization，FISH）為陽性則定義為HER-2受體陽性，若FISH為陰性則定義HER-2受體陰性。③免疫組織化學檢測為“+++”或FISH檢測陽性，兩者之一陽性即可定義HER-2受體陽性。

流式細胞檢查（flow cytometry，FCM）是20世紀70年代發展起來的對單細胞定量分析的一種新技術，它采用計算機、激光和熒光標記單克隆抗體技術，能在短期內對大量標本進行檢測，具有極高的檢測速度與統計精確性。而且從單一細胞可以同時測得多個參數，為生物醫學與臨床檢驗提供了一個全新視角和強有力的手段。經FCM檢測后一般能獲得三項參數：DNA倍體數（ploidy）、DNA指數（DNA Index DI）和細胞群體中進行DNA合成的增殖細胞的百分比（S-phase fraction，SPF）。DNA倍體是細胞核中重要遺傳物質DNA含量的一個客觀指標，腫瘤細胞的無限制分裂、增殖與細胞核中DNA含量變化密切相關。DNA倍體是組織細胞的基本生物學特性之一。腫瘤細胞DNA倍體變化不僅對腫瘤發生發展有重要理論意義，而且對腫瘤的診斷、鑒別診斷、腫瘤轉移、腫瘤治療和預后判斷也有一定的臨床意義[2]。S期指數是一項檢測DNA合成的增殖細胞百分比的指標，能較準確地計算處于增殖期的細胞比例，而腫瘤增殖強弱能體現其侵襲性。

1.研究對象：回顧性分析2010年1月～2013年1月鄭州人民醫院乳腺外科收治的乳腺癌病例，組織來源新鮮乳腺癌癌組織，在臨床工作中快速冰凍病理確診的乳腺癌，留取的癌灶組織；入選的乳腺癌病例，均為女性，全組135例乳腺癌，LumunalA型占52.6%（71/135），Luminal B型占24.4%（33/135），HER-2過表達型占8.9%（12/135），三陰性型占14.1%（19/135），大于等于50歲有52例，小于50歲有83例，平均年齡47.6歲，中位年齡48歲；按1997年UICC TNM分期，III期21例，II期94例，I期20例；腫瘤≤2cm 21例，2cm< ≤5cm 92例，>5cm 22例，淋巴結轉移66例，無淋巴結轉移69例。

2.研究方法

2.1 主要試劑

美國BD公司Ccycle TESTTMPLVS DNA Rent Kit試劑盒，磷酸緩沖液（PBS），A液（trysin buffer），B液（trysin inhibitor and RNase buffer），C液（propidium iodide stain solution）。

2.2 檢測方法

2.2.1 單細胞懸液樣品的制備

將新鮮病灶組織50-100mg剪碎或蠟塊組織去蠟后剪碎，同時用PH值為7.4的磷酸緩沖液（PBS）緩滴，用300目濾膜過濾，得到的單細胞倒入試管內離心（1000轉/分，5分鐘）；棄去上清液后，待檢。

2.2.2 DNA含量及倍體檢測的樣品制備

應用BD公司Ccycle TESTTMPLVS DNA Rent Kit試劑盒，PI染色法制備樣本；①在每個細胞懸液試管中加入250μl A液（trysin buffer），手輕叩試管（流式細胞術專用試管）使充分混合，放置10分鐘；②在每個加入A液試管中再加入200μl B液（trysin inhibitor and RNase buffer），手輕叩試管使充分混合，放置10分鐘；③在每個已經加入A、B液試管中再加入200μl 冷的（2℃～8℃）C液（propidium iodide stain solution）手輕叩試管使充分混合，在2℃～8℃冰箱內避光放置30分鐘，即可上機檢測。

2.2.3 主要儀器及校正

流式細胞檢測采用美國BD公司流式細胞儀FACSCalibur，激發光源為2W氬離子激光器，輸出功率300W，激發波長488nm，分別進行單參數檢測。上機前先以標準微球調整儀器，使CV<2%，DNA含量檢測前先做BD公司DNA質控下載質控條件檢測樣品DNA。DNA含量檢測以線性方式采集數據。DNA數據采用機載軟件分析。

3.研究結果：

表1：基線期三陰性與非三陰性臨床病理參數比較：

臨床病理參數 三陰性 非三陰性 x2 P值

年齡 0..26 0.871

<50歲 12 71

≥50歲 7 45

月經狀況 0.356 0.551

絕經前 15 84

絕經后 4 32

淋巴結轉移 0.407 0.523

有 8 58

無 11 58

臨床分期 2.053 0.358

I期 2 18

II期 12 82

III期 5 16

腫塊大小 0.667 0.717

≤2cm 2 19

2cm< ≤5cm 13 79

>5cm 4 18

三陰性與非三陰性乳腺癌病理參數之間無統計學差異；

表2：三陰性與非三陰性流式細胞學檢測結果：

三陰性 非三陰性 P值

S期細胞比率 9.32±4.89 5.65±4.14 0.01

二倍體 6 49 0.38

異倍體 13 67

SPF表達中三陰性明顯高于非三陰性，而倍體表達無統計學差異；

再對135例乳腺癌按年齡、淋巴結有無轉移、腫塊大小、臨床分期進行單因素分析SPF、進行統計學比較。

表3：單因素分析SPF與臨床病理參數

臨床病理參數 SPF平均值±標準差 P值

年齡 0.038

<50歲 5.52±3.67

≥50歲 7.12±5.25

淋巴結轉移 0.445

有 6.38±3.99

無 5.81±4.72

臨床分期 0.00

I期 5.09±4.87

II期 6.18±4.48

III期 6.83±3.83

腫塊大小 0.546

≤2cm 5.62±4.54

2cm< ≤5cm 6.29±4.62

>5cm 6.62±3.96

4.討論：

SPF高者細胞增生活躍，預后較差[3]。Charlotte R wenger等[4]總結了273篇有關乳腺癌SPF研究文獻指出，SPF與其他乳腺癌的預后指標有明顯的相關性，。SPF較高患者生存率較短。SPF可以反映乳腺癌的增殖活性和侵襲能力。另外，ER陽性者SPF較低而ER陰性者SPF較高是因為乳腺致癌后可失去合成ER的能力，ER表達有賴于細胞分化，與增殖呈負相關，這也比較合理地解釋了ER陽性患者乳腺癌患者預后較好的原因。高SPF與年齡因素有關，本研究中大于等于50歲SPF：7.12±5.25與小于50歲SPF：5.52±3.67比較有統計學意義，這與yuan ZY，Wang SS，等TNBC占全部乳腺癌的10%～20%，多見于絕經前的女性[5].的研究結果不同，本研究中SPF與臨床分期有關，臨床分期越高，SPF值較大但與腫塊大小無明顯相關性這與Brvan BB，Schnitt SJ等研究提示：TNBC與其他類型乳腺癌相比，預后差，生存時間短，腫塊較大[6，7]；研究結論之間的差異可能與本研究標本數量較少有關；Rakha EA，EL Sayed ME研究結果提示：高SPF腋窩淋巴結轉移率低[8]，與本研究SPF與淋巴結有無轉移無明顯相關性略有不同。與non-TNBC易出現淋巴結轉移不同，TNBC更易出現肝臟、肺部等內臟器官轉移[9]；TNBC患者不易出現腋窩淋巴結轉移，而易出現遠端器官肝臟、肺臟轉移，出現跳躍轉移征象；高SPF化療敏感性較高[10]但預后較差，出現這種矛盾的現象可能TNBC這一亞型可能有其特殊的生物學行為，有待進一步研究。

參考文獻：

[1]Crown J，O，Shaughnessy J，Gullo G，Emerging targeted therapies in triple-negative breast cancer[J].Ann Oncol，2012，23（6）：56-65..

[2]Martinez Jabaloyas JM，Jimeneez Sanchez Sanchex A，Ruiz Certla JL，etal.Prognostic Value DNA ploicly and nuclear morphometry in metaslatic prostale cancer[J].Actes Urol Esp，2004，28（4）：298-307.

[3]陳娟，張錦等.DNA含量及S期細胞比值與肺癌生物學特性的關系[J].西安交通大學學報，2006，27（3）：261-263.

[4]Charlortte R.S-phase fraction and breast cancer a decade of experience.Breast Cancer Reseach and Treatment，1998，51：255.

[5]yuan ZY，Wang SS，Gao Y，et al.Clinical charateristics and prognosis of triple-negative breast cancer：a reportor of 305cases[J]Ai Zheng，2008，27（6）：56-565.

[6]Brvan BB，Schnitt SJ，Collins LC.Ductal carcinoma in situ with basallike phenotype：a possible precusor to invasive bassal-like breast cancer[J].Mod Pathol，2006，19（5）：617-621；

[7]Gerson R，Alban F，Villalobos A，et Recurrence and survival rates among early breast cancer cases with triple negative immunophenotype[J].Gac Med，Mex，2008144（1）：27-34.

[8]Rakha EA，EL Sayed ME，Green AR，et al.Prognostic markers in triple-negative breast cancer[J].Cancer，2007，109（1）：25-32.；

[9]Rakha EA，EL Sayed ME，Green AR，et al.Prognostic markers in triple-negative breast cancer[J].Cancer，2007，109（1）：25-32.；

[10]張景臣，毛大華.S期細胞比率對乳腺癌新輔助化療敏感性的預測價值[J/CD].中華乳腺病雜志：電子版，2013，7（4）259-262.；

作者單位：1.鄭州人民醫院 乳腺科（張景臣 劉薇）2.貴陽醫學院第一附屬醫院（毛大華）

通信作者：河南 鄭州 450000 張景臣，