HPLC法測(cè)定錦燈籠果實(shí)中5種黃酮類成分含量

王志穎，宗穎，孫佳明，杜銳，*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林長(zhǎng)春130118；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長(zhǎng)春130117）

HPLC法測(cè)定錦燈籠果實(shí)中5種黃酮類成分含量

王志穎1，宗穎1，孫佳明2，杜銳1，*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林長(zhǎng)春130118；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長(zhǎng)春130117）

建立同時(shí)測(cè)定錦燈籠果實(shí)中5種黃酮類成分的高效液相色譜方法，為以后的錦燈籠質(zhì)量評(píng)價(jià)研究做鋪墊，并對(duì)5個(gè)不同產(chǎn)地的錦燈籠果實(shí)中黃酮含量進(jìn)行測(cè)定。采用HPLC法，流動(dòng)相甲醇-水，梯度洗脫；柱溫30℃；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm。結(jié)果表明5種黃酮類成分的線性關(guān)系良好，精密度、穩(wěn)定性良好，符合測(cè)定要求。采用高效液相色譜法測(cè)定錦燈籠果實(shí)中5種黃酮類成分方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，對(duì)5個(gè)不同產(chǎn)地樣品測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。

錦燈籠果實(shí)；高效液相色譜；黃酮

錦燈籠（Physalis alkekengi，L.var.francheti（Mast.）Makino）又名酸漿、掛金燈、燈籠果、紅姑娘等，為茄科（Solanaceae）酸漿屬植物，在俄羅斯、韓國(guó)、中國(guó)、日本以及朝鮮等國(guó)家都有生長(zhǎng)，廣泛分布于歐亞大陸［1-3］。在《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載，被列為中品［4］。錦燈籠的根，全草及果實(shí)均可入藥，其果實(shí)性味甘，有清涼解毒，消腫止痛，利尿，止咳，化痰之功效［5-6］。作為我國(guó)的傳統(tǒng)中藥，現(xiàn)代研究表明，錦燈籠有多方面的藥理作用［7-10］。錦燈籠中含有的黃酮類化合物種類較多，具有較好的生物活性，對(duì)錦燈籠質(zhì)量評(píng)價(jià)具有較大的意義［11-12］。

本實(shí)驗(yàn)以木犀草苷、蘆丁、槲皮苷、槲皮素、木犀草素5種黃酮類化合物為指標(biāo)，采用超聲輔助溶劑提取法對(duì)樣品進(jìn)行處理，建立高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)5種黃酮含量的條件，并檢測(cè)了5個(gè)不同產(chǎn)地樣品中黃酮含量，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，準(zhǔn)確。

1材料與方法

1.1材料

錦燈籠果實(shí)由宗穎老師提供，鑒定為茄科（Solanaceae）酸漿屬植物錦燈籠（Physalis alkekengi L.var.franchetii（Mast.）Makino）。

木犀草苷（0724-200806）、蘆丁（10008-200707）、槲皮苷（10183-201009）、槲皮素（11082-200705）、木犀草素（10008-200903）均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇（色譜純）：美國(guó)Fisher公司；乙醇（分析純）：北京化工廠。

1.2儀器與設(shè)備

LC-2010液相色譜儀（SPD-20Avp紫外檢測(cè)器、柱溫箱、化學(xué)工作站）、UV2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；Nucleosil C18ODS色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）：大連依利特公司；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1對(duì)照品溶液的制備

精密稱定木犀草苷、蘆丁、槲皮苷、槲皮素、木犀草素各10 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解、定容，制成混合對(duì)照品溶液。

1.3.2樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取錦燈籠果實(shí)樣品10.0 g于250 mL錐形瓶中，取90%乙醇150mL，超聲提取3次，每次30min，合并提取液，濃縮至干，用甲醇定容于10 mL容量瓶，制成樣品溶液，測(cè)定前用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，備用。

1.3.3色譜條件

Nucleosil C18ODS色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）和水（B）；梯度洗脫：0～15 min 35%～40%（A），15 min～30 min 40%～50%（A），30 min～40 min 50%～55%（A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：350 nm；柱溫：30℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密移取1.3.1項(xiàng)的混合對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL，分別置于10 mL容量瓶，用甲醇定容，得到不同濃度的混合對(duì)照品溶液，采用1.3.3項(xiàng)液相條件，測(cè)定5種黃酮峰面積，以各濃度為橫坐標(biāo)（x）、積分面積值為縱坐標(biāo)（y），進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液中5種黃酮的回歸方程。

2結(jié)果與分析

2.1混合對(duì)照品及錦燈籠樣品色譜峰

混合對(duì)照品色譜峰見(jiàn)圖1，錦燈籠樣品色譜峰見(jiàn)圖2。

2.2混合標(biāo)準(zhǔn)品中5種黃酮的線性回歸方程

5種黃酮的線性回歸方程見(jiàn)表1。

以黃酮濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。本方法測(cè)定錦燈籠果實(shí)中木樨草苷、蘆丁、槲皮素苷、槲皮素、木樨草素，線性關(guān)系良好。

圖1　混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰Fig.1HPLC chromatograms of mixed standard

圖2　錦燈籠樣品色譜峰Fig.2HPLC chromatograms of sample

表1　5種黃酮的線性回歸方程Table 1Regression equations with correlation coefficients of 5 flavonoid

2.3方法學(xué)考察

2.3.1精密度實(shí)驗(yàn)

按“1.3.3”條件，取黃酮混合標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定得到峰面積，計(jì)算木犀草苷、蘆丁、槲皮苷、槲皮素、木犀草素峰面積的RSD值分別為1.32%、1.71%、0.96%、1.08%、1.19%（n＝6），表明精密度良好。

2.3.2穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取黃酮混合標(biāo)準(zhǔn)品，按“1.3.3”條件，分別于0、0.5、1、1.5、2.0、2.5h進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜峰面積無(wú)明顯變化，計(jì)算木犀草苷、蘆丁、槲皮苷、槲皮素、木犀草素峰面積的RSD值分別為2.41%、1.69%、1.03%、2.11%、1.33%（n＝6），表明穩(wěn)定性良好。

2.3.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一錦燈籠樣品溶液，按“1.3.3”條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定得到峰面積，計(jì)算木犀草苷、蘆丁、槲皮苷、槲皮素、木犀草素峰面積的RSD值分別為1.13%、1.17%、2.07%、1.59%、2.52%（n＝6），表明本方法重復(fù)性較好。

2.3.4加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液與6份已知各黃酮含量的錦燈籠樣品溶液混合，濃縮至干，定容，按“1.3.2”項(xiàng)操作，在“1.3.3”條件下進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　5種黃酮的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Table 2Recovery rates of 5 flavones in a known sample（n＝6）

結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)提取和處理方法對(duì)錦燈籠種黃酮類成分的回收率介于99%～103%，符合測(cè)定要求。

2.4不同產(chǎn)地錦燈籠中黃酮的含量測(cè)定

5種不同產(chǎn)地錦燈籠果實(shí)中黃酮含量見(jiàn)表3。

表3　5種不同產(chǎn)地錦燈籠果實(shí)中黃酮含量Table 3Contents of flavones in Physalis alkekengi L.var.franchetii from 5 different area

在不同產(chǎn)地的錦燈籠果實(shí)黃酮含量測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，在距離較近的地區(qū)，黃酮含量差異較小，但長(zhǎng)春地區(qū)錦燈籠中黃酮含量較高，在吉林和通化地區(qū)黃酮含量較低，而且吉林和通化錦燈籠中黃酮含量相差也較大。

3討論與結(jié)論

錦燈籠中的黃酮類成分熱穩(wěn)定性較差，為了不破壞錦燈籠中的待測(cè)成分，采用超聲提取法，在室溫條件下對(duì)錦燈籠進(jìn)行提取。在此條件下制備的樣品溶液在測(cè)定指標(biāo)區(qū)域內(nèi)峰型簡(jiǎn)單，沒(méi)有其他成分干擾。

對(duì)于錦燈籠中的黃酮類成分測(cè)定方法較多，主要采用紫外分光光度法測(cè)定，或是采用HPLC法對(duì)錦燈籠中單一成分進(jìn)行含量測(cè)定［13-14］。在前人的工作的基礎(chǔ)上，綜合其他植物中黃酮類成分的測(cè)定方法，建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定錦燈籠中的5種黃酮類成分的條件，具有分離度好，準(zhǔn)確性高，方法簡(jiǎn)便可行，不僅為以后錦燈籠果實(shí)的化學(xué)成分研究提供了很好的理論依據(jù)，同時(shí)也為錦燈籠在食品控制和質(zhì)量評(píng)價(jià)上建立了較好的方法。

采用本實(shí)驗(yàn)建立的方法對(duì)不用產(chǎn)地的錦燈籠果實(shí)中黃酮進(jìn)行了含量測(cè)定，結(jié)果顯示，長(zhǎng)春地區(qū)的錦燈籠果實(shí)的黃酮含量較高，為以后的錦燈籠進(jìn)一步研究提供參考。

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HPLC Determination of 5 Flavones in Physalis alkekengi，L.var.

WANG Zhi-ying1，ZONG Ying1，SUN Jia-ming2，DU Rui1，*
（1.Jilin Agricutural University，Changchun 130118，Jilin，China；2.Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，Jilin，China）

A high performance liquid chromatography method was established to simultaneously determine 5 flavones，Physalis alkekengi，L.var.fruit quality evaluation research is made later，and Contents of flavones from 5 different area is determined。5 flavones were separated by HPLC，with amobile phasecomposed of acetonitrile and water at a flow rate of 1.0 mL/min through gradient elution.The detection wavelength was 350 nm.An excellent linear relationship between peak areas and concentrations of 5 flavones is established.By high performance liquid chromatography determination of 5 kinds of flavonoids in Physalis alkekengi，L.var.fruit composition method is simple and accurate，and 5 different origin samples determination result is stable and reproducible.

Physalis alkekengi，L.var.fruit；HPLC；flavonoid

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.10.023

2014-03-04

吉林省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（吉教科合字［2012］第50號(hào)）

王志穎（1991—），女（漢），碩士研究生，主要從事中藥有效成分的研究與開(kāi)發(fā)利用的研究工作。

杜銳（1971—），男（漢），教授，博士，主要從事中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究工作。