全緣栝樓多糖及提取物不同極性部位抗氧化研究

潘喬丹，唐海燕，黃元河，韋賢，李巨寶，李雄富

（右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西百色533000）

全緣栝樓多糖及提取物不同極性部位抗氧化研究

潘喬丹，唐海燕，黃元河*，韋賢，李巨寶，李雄富

（右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西百色533000）

研究全緣栝樓多糖和提取物不同極性部位體外抗氧化活性。采用清除羥自由基（OH·）、［2，2＇-連氨-（3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸）二氨鹽］自由基（ABTS+·）、DPPH測(cè)定法以及Fe3+還原/抗氧化能力（FRAP）法，評(píng)價(jià)全緣栝樓多糖和提取物不同極性部位的抗氧化能力。全緣栝樓多糖和提取物不同極性部位清除DPPH·能力均強(qiáng)于抗壞血酸（IC50= 1.22 mg/mL），且多糖（IC50=0.030 mg/mL）和乙酸乙酯層（IC50=0.082 mg/mL）比茶多酚強(qiáng)（IC50=0.118 mg/mL）；多糖（IC50=0.031 mg/mL）清除OH·能力比茶多酚（IC50=0.032 mg/mL）和抗壞血酸（IC50=0.044 mg/mL）強(qiáng)，而石油醚層（IC50=0.033 mg/mL）和乙酸乙酯層（IC50=0.038mg/mL）強(qiáng)于抗壞血酸；清除ABTS+·能力均強(qiáng)于茶多酚（IC50=0.416mg/mL），且多糖（IC50=0.008 mg/mL）強(qiáng)于抗壞血酸（IC50=0.011 mg/mL）；Fe3+還原/抗氧化能力均強(qiáng)于茶多酚（FRAP= 1 310.8 μmol/g），但比抗壞血酸弱（FRAP=31 469 μmol/g）。全緣栝樓多糖和提取物不同極性部位有較強(qiáng)的抗氧化能力，為其生物活性的深入研究提供了參考依據(jù)。

全緣栝樓；多糖；不同極性部位；抗氧化

全緣栝樓（Trichosanthes ovigera Bl.）為栝樓屬植物，據(jù)《廣西藥用植物名錄》記載，全緣栝樓根具有清熱解毒、利水、去瘀的功效，用于治療跌打骨折、癰瘡腫毒；其果皮和種子用于治肺熱咳嗽、便秘、咽喉痛、癰瘡腫毒。還具有抗艾滋病病毒的作用［1］，在民間作為野生水果食用。人們對(duì)全緣栝樓抗氧化方面的研究較少。本研究采用四種體外抗氧化方法研究全緣栝樓多糖和提取物不同極性部位的抗氧化活性，為全緣栝樓進(jìn)一步綜合開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1儀器、試劑、樣品

1.1儀器

DF-15臺(tái)式連續(xù)投料粉碎機(jī)：溫嶺市林大機(jī)械有限公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HHS-21-4電熱式恒溫水浴鍋：江蘇金壇宏凱儀器廠；TU-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FA1104型電子天平：上海良平儀器儀表有限公司；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器。

1.2藥材

全緣栝樓（Trichosanthes ovigera Bl.）采于廣西百色。實(shí)驗(yàn)用其果實(shí)，干燥后粉碎成粉末。

1.3試劑

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（J＆K CHEMICAL LTD）、三吡啶三吖嗪（tripyridyl-triazine，TPTZ，Aladdin）、2，2＇-連氨-（3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸）二氨鹽（ABTS，生工生物公司）、1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH，上海楷洋生物技術(shù)有限公司）、抗壞血酸（天津博迪化工股份有限公司）、茶多酚（廣州食品添加劑公司）；其它試劑均為分析純。

2方法

2.1多糖的提取和含量測(cè)定

稱(chēng)取全緣栝樓粉50.0 g，經(jīng)石油醚（60℃～90℃）回流脫脂兩次，1.0 h/次。再用95%乙醇回流提取兩次，2 h/次，以除去單糖和低聚糖，將藥渣烘干備用。將已處理好的藥渣加蒸餾水用超聲波（100 W）提取3次，每次2 h。合并提取液濃縮后經(jīng)醇沉、除蛋白后濃縮至干，得精多糖樣品4.750 g。稱(chēng)取全緣栝樓多糖0.100 0 g，加蒸餾水配制成2.0 g/L的母液，再稀釋成不同濃度的溶液備用。

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，配制不同濃度梯度，采用苯酚-硫酸法［2］，首先在300 nm～900 nm波長(zhǎng)掃描，最后確定在490 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度A與濃度C進(jìn)行直線回歸，A=20.67C-0.076 8（r=0.999 5），線性范圍為0.01 mg/mL～0.05 mg/mL。由回歸方程計(jì)算全緣栝樓多糖的含量，多糖含量計(jì)算公式：

多糖含量（mg/g）=多糖質(zhì)量（mg）/原料質(zhì)量（g）

2.2不同極性部位的提取

稱(chēng)取全緣栝樓粉50.0 g，用250 mL 95%乙醇于超聲波儀中提取3次，每次2 h。合并提取液濃縮干燥得總提取物（EE）12.95 g；將總提取物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，濃縮干燥得石油醚層（PEE）6.71 g、乙酸乙酯層（EAE）0.42 g、正丁醇層（BE）2.56 g和水層（WE）2.42 g的不同極性部位。取各不同極性部位樣品各0.05 g，用80%乙醇稀釋至0.050 mg/mL的溶液備用。并各不同極性部位備用液用80%乙醇逐級(jí)稀釋成濃度為0.005、0.010、0.015、0.020、0.025 mg/mL的受試溶液。

2.3抗氧化測(cè)定

2.3.1DPPH清除率的測(cè)定

參照Kim［3］等和霍麗妮［4］等方法，取2.0 mL樣品溶液，加入0.4 mmol/L DPPH·溶液2.0 mL，避光30 min后于515 nm處測(cè)吸光值。通過(guò)下式計(jì)算對(duì)DPPH的清除率：

式中：A0為溶劑代替樣品的吸光度；A1為樣品的吸光度；A1′為無(wú)水乙醇代替DPPH的空白對(duì)照組。

2.3.2清除羥自由基（OH·）能力的測(cè)定（水楊酸法）

利用Fenton反應(yīng)法［5-6］。分別移取不同濃度的溶液2.0 mL于試管中，加入1.0×10-2mol/L FeSO41.0 mL，1.0×10-2mol/L水楊酸-乙醇溶液2.0 mL，最后加入30% H2O22.0 mL啟動(dòng)反應(yīng)，于室溫下反應(yīng)1 h。以蒸餾水調(diào)零，測(cè)λ510樣品的吸光度。考慮到試劑與提取物溶液的協(xié)同增色效應(yīng)，以蒸餾水2.0 mL替代30%H2O22.0 mL，其它試劑與樣品組相同。每份樣品平行操作3次，取均值，計(jì)算公式為：

式中：A0為溶劑代替樣品液的吸光度；A1為樣品組的吸光度；A1′為蒸餾水代替H2O2的空白對(duì)照組吸光度。

2.3.3清除ABTS+自由基能力的測(cè)定（ABTS法）

參考Re等［7］的方法，分別移取不同濃度的溶液2.0 mL于試管中，各試管中加入4.0 mL ABTS+·測(cè)定液，振蕩30 s，測(cè)定在734 nm波長(zhǎng)處的吸光度，每份樣品平行操作3次，取均值，計(jì)算公式為：

式中：A0為ABTS+·測(cè)定液的吸光度；A1為樣品組的吸光度。

2.3.4總抗氧化能力的測(cè)定（FRAP法）

參照Orhan［8］和章英等［9］的方法，分別移取不同濃度的溶液2.0 mL于試管中，加入2.0 mLFRAP工作液，于593 nm處測(cè)吸光度A，各組實(shí)驗(yàn)均做3次平行，取均值。結(jié)果均以FeSO4當(dāng)量（即每克樣品的總抗氧化能力相當(dāng)于FeSO4的微摩爾數(shù)）表示。

2.3.5半清除率濃度計(jì)算

根據(jù)回歸方程計(jì)算清除率為50%時(shí)的濃度（IC50，mg/mL）。

3結(jié)果與討論

3.1多糖含量的測(cè)定

根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的回歸方程，計(jì)算出全緣栝樓多糖含量為92.748 mg/g。

3.2清除DPPH自由基作用

清除DPPH自由基IC50值見(jiàn)表1。

表1　全緣栝樓多糖和提取物不同極性部位的抗氧化活性Table 1Antioxidant activity of polysaccharides and different polarity parts of extract from Trichosanthes ovigera Bl.

從表1可以看出，全緣栝樓多糖和提取物不同極性部位具有一定的清除DPPH自由基的能力，由IC50與清除能力大小成負(fù)相關(guān)，即IC50越小則清除能力越強(qiáng)的關(guān)系，得出清除DPPH自由基能力依次為：多糖＞乙酸乙酯層＞茶多酚＞正丁醇層＞總提取物＞水層＞石油醚層＞抗壞血酸。可見(jiàn)，多糖和不同極性部位清除DPPH自由基的能力都強(qiáng)于抗壞血酸，多糖和乙酸乙酯層的清除DPPH自由基的能力強(qiáng)于茶多酚。

3.3清除羥自由基作用

清除羥自由基作用及IC50值見(jiàn)圖1、表1。

圖1　全緣栝樓多糖和提取物不同極性部位清除羥自由基作用Fig.1Effect of scavenging OH·of polysaccharides and different polarity parts of extract from Trichosanthes ovigera Bl.

由圖1可以看出，全緣栝樓多糖和提取物不同極性部位對(duì)OH·自由基都表現(xiàn)出較高的清除能力，并在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)呈明顯的量效關(guān)系，隨著濃度的增加，清除率也是增高的。水層、正丁醇層清除率曲線相對(duì)平緩，石油醚層清除率遞增趨勢(shì)相對(duì)明顯，乙酸乙酯層次之，由表1的半清除率濃度IC50值及其與清除能力大小成負(fù)相關(guān)的關(guān)系，可知對(duì)OH·自由基的清除能力順序?yàn)椋憾嗵牵静瓒喾樱臼兔褜樱疽宜嵋阴樱究箟难幔究偺崛∥铮舅畬樱菊〈紝印？梢?jiàn)，多糖、石油醚層和乙酸乙酯層對(duì)OH·自由基的清除能力強(qiáng)于抗壞血酸，且多糖強(qiáng)于茶多酚。

3.4清除ABTS+自由基作用

清除ABTS+自由基作用及IC50值見(jiàn)圖2、表1。

圖2　全緣栝樓多糖和提取物不同極性部位清除ABTS+自由基作用Fig.2Effect of scavenging ABTS+·of polysaccharides and different polarity parts of extract from Trichosanthes ovigera Bl.

由圖2可以看出，全緣栝樓多糖和提取物不同極性部位對(duì)ABTS+自由基都有一定程度的清除能力。乙酸乙酯層的清除率和濃度呈較明顯的遞增關(guān)系，正丁醇次之，石油醚的最不明顯。由表1的半清除率濃度IC50值大小及其與清除能力大小成負(fù)相關(guān)的關(guān)系，可知對(duì)ABTS+自由基的清除能力順序?yàn)椋憾嗵牵究箟难幔疽宜嵋阴樱菊〈紝樱究偺崛∥铮舅畬樱臼兔褜樱静瓒喾印Ｓ纱丝梢?jiàn)，清除ABTS+自由基的能力中，多糖和提取物不同極性部位均強(qiáng)于茶多酚，且多糖強(qiáng)于抗壞血酸。

3.5總抗氧化能力的測(cè)定

在593 nm處，F(xiàn)eSO4濃度Y與吸光度X在一定范圍內(nèi)呈線性劑量關(guān)系，線性回歸方程為：Y=0.000 5X-0.009 9（r=0.998 9）。根據(jù)反應(yīng)后的吸光度值A(chǔ)，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得相應(yīng)的FeSO4當(dāng)量（μmol/g）。表1所示，對(duì)Fe3+的還原能力順序?yàn)椋嚎箟难幔菊〈紝樱舅畬樱径嗵牵究偺崛∥铮疽宜嵋阴樱臼兔褜樱静瓒喾印？梢?jiàn)，多糖和不同極性部位的Fe3+還原/抗氧化能力均弱于抗壞血酸，強(qiáng)于茶多酚。

4結(jié)論

從日前研究結(jié)果揭示的證據(jù)表明自由基幾乎和人類(lèi)大部分常見(jiàn)的幾種主要疾病都有關(guān)系，從人類(lèi)死亡率最高的心腦血管疾病，到人類(lèi)最可怕的癌癥，無(wú)一不和自由基有著密切關(guān)系［10-11］。尋找安全、有效的天然自由基清除劑已成為當(dāng)前研究的熱題。本文采用DPPH法、水楊酸法、ABTS法和FRAP法對(duì)全緣栝樓多糖和提取物不同極性部位進(jìn)行體外抗氧化活性研究，通過(guò)比較清除DPPH·、OH·、ABTS+·的IC50值和FRAP當(dāng)量大小判斷其對(duì)DPPH·、OH·、ABTS+·的清除能力和對(duì)Fe3+的還原/抗氧化能力，并與抗壞血酸和茶多酚兩種常用的抗氧化劑相比較。通過(guò)比較各IC50值或FRAP當(dāng)量值，提取物不同極性部位清除DPPH能力均強(qiáng)于抗壞血酸，但比茶多酚弱（除乙酸乙酯層外）；清除OH·能力均比茶多酚弱，而石油醚層和乙酸乙酯層強(qiáng)于抗壞血酸；清除ABTS+·和Fe3+還原/抗氧化能力均比抗壞血酸弱，強(qiáng)于茶多酚；而全緣栝樓多糖清除DPPH·、OH·、ABTS+·的能力均強(qiáng)于茶多酚和抗壞血酸；說(shuō)明，全緣栝樓多糖和提取物不同極性部位具有較強(qiáng)的抗氧化能力，尤其是多糖。這一研究為全緣栝樓的進(jìn)一步研究以及開(kāi)發(fā)、應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

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Antioxidant Activity of Polysaccharides and Different Polarity Chemical Fractions of Extract from Trichosanthes ovigera Bl.

PAN Qiao-dan，TANG Hai-yan，HUANG Yuan-he*，WEI Xian，LI Ju-bao，LI Xiong-fu
（Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，Guangxi，China）

To study the antioxidant activity of polysaccharides and different polarity chemical fractions of extract from Trichosanthes ovigera.The antioxidant activities of polysaccharides and different polarity chemical fractions of extract from Trichosanthes ovigera were evaluated by DPPH free radical scavening assay，and hydroxyl free radical（OH·）scavenging assay，and［2，2＇-Azino-bis（3-ethylbenzo thia zoline-6-sulfonic acid）］diammonium salt radical（ABTS+·）and ferric reducing antioxidant power（FRAP）assay.DPPH free radical scavening activity of polysaccharides and different polarity chemical fractions of extract from Trichosanthes ovigera were higher than VC（IC501.22 mg/mL），and polysaccharides（IC500.030 mg/mL）and ethylacetate fraction（IC500.082 mg/mL）were higher than tea polyphenol（IC500.118 mg/mL）.OH·scavenging activity of polysaccharides（IC500.031 mg/mL）were higher than tea polyphenol（IC500.032 mg/mL）and VC（IC500.044 mg/mL），and petroleum ether（IC500.033 mg/mL）and ethylacetate fraction（IC500.038 mg/mL）were higher than VC.ABTS+·scavenging activity and ferric reducing antioxidant capacity of polysaccharides and different polarity chemical fractions of extract were higher than tea polyphenol were higher than tea polyphenol（IC500.416 mg/mL，F(xiàn)RAP 1 310.8μmol/g），and ABTS+·scavenging activity of polysaccharides（IC500.008 mg/mL）higher than VC（IC500.011 mg/mL）.Polysaccharides and different polarity chemical fractions of extract from Trichosanthes ovigera had strong antioxidative activity，this conclusion would provide important evidences for the further study of the bioactivity.

Trichosanthes ovigera Bl；polysaccharides；different polarity chemical fractions；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.10.001

2014-01-22

廣西區(qū)中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（gzzc1181）；中醫(yī)藥公共衛(wèi)生專(zhuān)項(xiàng)“國(guó)家基本藥物所需中藥原料資源調(diào)查和監(jiān)測(cè)項(xiàng)目（財(cái)社［2011］76號(hào)）；中醫(yī)藥行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)”我國(guó)代表性區(qū)域特色中藥資源保護(hù)利用”（201207002）

潘喬丹（1980—），女（漢），講師，碩士，從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。

黃元河（1979—），男（壯），講師，碩士，從事中藥資源研究。