響應(yīng)面法優(yōu)化丁香葉總酚酸提取工藝

吳　燕，盛尊來，高凌飛，陳儉清，李艷華（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

響應(yīng)面法優(yōu)化丁香葉總酚酸提取工藝

吳燕，盛尊來，高凌飛，陳儉清，李艷華*
（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

采用響應(yīng)面法對丁香葉總酚酸的乙醇提取工藝進行優(yōu)化。以總酚酸提取率為考察指標，在單因素實驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對乙醇濃度、提取溫度、提取時間和液料比等提取條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，乙醇回流提取總酚酸的最佳工藝條件為：乙醇濃度44%、提取溫度90℃、提取時間96min、液料比25.2∶1（mL/g）、提取次數(shù)為2次，在此條件下提取率為（1.642±0.23）mg/g。響應(yīng)面優(yōu)化得到的提取工藝穩(wěn)定合理，準確可靠，是提取丁香葉總酚酸的可行方法。

丁香葉，總酚酸，響應(yīng)面，提取工藝

紫丁香葉為木樨科（Oleaceae）丁香屬（Syringa）丁香的干燥葉，味苦、性寒，其所含主要化學(xué)成分有有機酸類、苷類、揮發(fā)油等成分［1］。其中，總酚酸類化合物所具有的保健功能主要表現(xiàn)在清除體內(nèi)自由基、舒張血管、抗癌、抗病毒、抗菌消炎、抗過敏等方面［2］。其較強抗氧化活性與其所含的酚酸類成分有關(guān)［3-4］，丁香葉中的水溶性酚酸類成分（丹酚酸、迷迭香酸、原兒茶酸、咖啡酸、丹參素等）具有很強的抗脂質(zhì)過氧化和清除自由基作用［5-6］。

目前，總酚酸類化合物具有抗氧化和清除自由基的活性受到了廣泛的關(guān)注，但國內(nèi)對丁香葉中有效成分的提取研究主要集中在黃酮類化合物［7］、總皂苷［8］、丁香酚［9］等方面，對丁香葉中酚酸類成分提取工藝研究較少。為了使丁香葉更廣泛的應(yīng)用于食品添加劑和功能性食品開發(fā)領(lǐng)域中，本研究采用響應(yīng)面（response surface methodology，RSM）分析法對丁香葉總酚酸的提取工藝進行優(yōu)化，并對丁香葉總酚酸提取物的抗氧化活性進行了初步研究，旨為丁香葉的綜合開發(fā)利用提供一定理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

丁香葉采自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，采收期為2013年9月；原兒茶酸標準品中國藥品生物制品檢定所生產(chǎn)（批號：20120325，純度≥98%）；乙醇、鉬酸鈉、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸等均為分析純試劑。

UV-8000A紫外分光光度計上海市元析儀器有限公司；DH6000A電熱恒溫水浴鍋天津市泰斯特儀器有限公司；DHG-9070型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海恒科學(xué)儀器有限公司；BT224S分析天平賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1丁香葉總酚酸提取精密稱量丁香葉粗粉5.00g，置250mL圓底燒瓶中，乙醇回流法在不同的提取條件下提取，提取液抽濾后，用蒸餾水定容至500mL，并精密吸取50mL，加入1mol/L的鹽酸溶液10mL，加蒸餾水定容至100mL，備用［10］。

1.2.2標準曲線的制備采用紫外分光光度計法，以原兒茶酸為考察指標測定總酚酸含量［11］。精密稱取原兒茶酸對照品（原兒茶酸對照品，在105℃干燥至恒重）12.8mg，加乙醇5mL使溶解，加鹽酸液（1mol/L）5mL，用蒸餾水定容至50mL，得濃度為0.0256mg/mL的原兒茶酸標準液，分別精密吸取原兒茶酸標準液0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4mL于25mL棕色容量瓶中，精密加入鹽酸溶液（6mol/L）0.4mL，亞硝酸鈉-鉬酸鈉溶液（亞硝酸鈉10g，鉬酸鈉15g，加水溶解使成100mL）1mL，搖勻，放置5min，加氫氧化鈉液（1mol/L）5mL，搖勻，分別加水稀釋至刻度，搖勻；另取相應(yīng)含量的標準液，除不加亞硝酸鈉-鉬酸鈉溶液外，分別用同一方法處理后，作為空白，于503nm處測定吸光度值。以原兒茶酸濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程y=64.886x-0.0106（r2=0.9999）。總酚酸以原兒茶酸計在0.02048～0.01229mg/mL線性關(guān)系良好。

1.2.3丁香葉總酚酸提取單因素實驗分別考察乙醇濃度、提取溫度、提取時間、液料比和提取次數(shù)5個因素對丁香葉總酚酸提取率的影響，以丁香葉總酚酸提取率為考察指標進行評價和分析，以確定最佳參數(shù)。精密吸取供試品溶液1mL，按1.2.2項下方法操作并測定吸光度，每個實驗重復(fù)三次。按以下公式計算提取率：式中：c為稀釋的提取液中丁香葉總酚酸的濃度，單位為mg/mL；25為吸取丁香葉總酚酸提取物最終定容至25mL；1000為稀釋倍數(shù)；m為丁香葉粉質(zhì)量，單位為g。

因此，理想的社區(qū)治理格局是在基層社區(qū)黨組織的領(lǐng)導(dǎo)下，基層政府及派出機構(gòu)和社區(qū)自治組織以社區(qū)為載體，搭建基層公共事務(wù)運行平臺、社會組織運作平臺以及居民參與社會事務(wù)的運轉(zhuǎn)平臺[8]。這是結(jié)果導(dǎo)向的理想式社區(qū)治理模式架構(gòu)，但這一架構(gòu)僅是社區(qū)治理的運行結(jié)果狀態(tài)，并不是路徑選擇。要達到這種理想化的運行結(jié)果，對現(xiàn)實的改造和重塑是不可或缺的環(huán)節(jié)。

1.2.3.1乙醇濃度對丁香葉總酚酸提取率的影響當提取溫度80℃、時間1h、液料比20∶1（mL/g）、提取次數(shù)為1次時，考察0%、20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液對丁香葉總酚酸提取率的影響。

1.2.3.2提取溫度對丁香葉總酚酸提取率的影響當乙醇濃度40%、時間1h、液料比20∶1、提取次數(shù)為1次時，考察50、60、70、80、90、100℃的溫度對丁香葉總酚酸提取率的影響。

1.2.3.3提取時間對丁香葉總酚酸提取率的影響當乙醇濃度40%、溫度90℃、液料比20∶1、提取次數(shù)為1次時，考察40、60、80、100、120min對丁香葉總酚酸提取率的影響。

1.2.3.4液料比對丁香葉總酚酸提取率的影響當乙醇濃度40%、提取時間100min、溫度90℃、提取次數(shù)為1次時，考察15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、40∶1（mL/g）的液料比對丁香葉總酚酸提取率的影響。

1.2.3.5提取次數(shù)對丁香葉總酚酸提取率的影響當乙醇濃度40%、提取時間100min、溫度90℃，液料比25∶1時，考察提取次數(shù)1、2、3、4次對丁香葉總酚酸提取率的影響。

1.2.4響應(yīng)面優(yōu)化工藝條件當提取次數(shù)為2次時，總酚酸提取率基本就不再改變，因此在本研究中確定提取次數(shù)為兩次前提下，采用統(tǒng)計分析軟件Design-Expert 8.0.6，根據(jù)Box-Behnken的中心組合實驗設(shè)計原理，基于單因素實驗結(jié)果，以乙醇體積分數(shù)（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）、液料比（D）為自變量，丁香葉總酚酸提取率（Y）為響應(yīng)值，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法進行實驗設(shè)計，因素水平設(shè)計見表1。

表1　丁香葉總酚酸提取響應(yīng)面分析實驗設(shè)計因素與水平表Table 1　Variables and levels in response surface design

1.2.5數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實驗的平均值，單因素實驗數(shù)據(jù)運用Origin7.5軟件繪制趨勢曲線圖；響應(yīng)面實驗采用Design-Expert 8.0.6軟件進行方差分析，并優(yōu)化出最佳提取工藝。

2　結(jié)果與分析

2.1.1乙醇濃度對丁香葉總酚酸提取率的影響從圖1可看出，隨乙醇濃度的升高，總酚酸提取率呈先上升后下降趨勢，當乙醇濃度為40%時提取率值最高。說明40%的乙醇溶液有利于總酚酸類物質(zhì)的溶出，而當乙醇濃度升高時，提取率降低，這是由于一些脂溶性成分、醇溶性雜質(zhì)降低了組織的通透性，從而使總酚酸的提取率下降［12］。因此40%乙醇為優(yōu)化的中心點。

2.1.2提取溫度對丁香葉總酚酸提取率的影響從圖2可看出，隨著溫度升高，總酚酸提取率逐漸升高，這是由于溫度升高有助于傳質(zhì)過程，使分子擴散運動激烈，加快溶質(zhì)的擴散和溶劑的滲透，有利于總酚酸類物質(zhì)的溶出，在90℃時提取率最高，100℃時略有下降，這是由于溫度過高，總酚酸中可能有一些成分結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定而被破壞，活性降低［13］，鑒于總酚酸的熱穩(wěn)定性，將90℃定為優(yōu)化的中心點。

圖2　提取溫度對總酚酸提取率的影響Fig.2　Effect of extraction temperature on total phenolic acids extraction rate

2.1.3提取時間對丁香葉總酚酸提取率的影響從圖3可看出，隨提取時間延長，總酚酸提取率迅速升高后，60～80min內(nèi)總酚酸含量趨于平穩(wěn)后再升高，這段時間總酚酸的溶出達到飽和，溶出速率趨于平衡。當提取時間為100min時，提取率達到最高，隨著提取時間繼續(xù)延長，提取率開始下降。這可能是由于總酚酸類物質(zhì)溶出的時間不一致，隨著時間的延長，有些酚酸發(fā)生縮合、降解、氧化等化學(xué)反應(yīng)，從而使總酚酸含量下降［14］。因此100min為優(yōu)化的中心點。

圖3　提取時間對總酚酸提取率的影響Fig.3　Effect of extraction time on total phenolic acids extraction rate

2.1.4液料比對丁香葉總酚酸提取率的影響從圖4可看出，隨液料比增加，總酚酸取率呈先升后降趨勢，當液料比為25∶1時達峰值。溶劑量的增加使物料與溶劑接觸面積、溶液傳質(zhì)推動力均增大，濃度梯度變大，有利于總酚酸的溶出，從而使其溶出速度和提取率變大，當液料比一定時，提取率最高，隨著液料比的繼續(xù)增加，溶劑體積增加使得物料吸附溶劑的量也逐漸變大，從而導(dǎo)致總酚酸被物料吸附而不易溶出［15］。因此25∶1為優(yōu)化的中心點。

2.1.5提取次數(shù)對丁香葉總酚酸提取率的影響從圖5可看出，當提取次數(shù)大于2次時，總酚酸提取率沒有發(fā)生明顯的改變，且提取次數(shù)越多，提取液的體積越大，將給后續(xù)的濃縮帶來影響，并造成大量的動力損耗，因此提取次數(shù)為2次時為該工藝的最佳提取次數(shù)。

圖4　液料比對總酚酸提取率的影響Fig.4　Effect of liquid/material ratio on total phenolic acids extraction rate

圖5　提取次數(shù)比對總酚酸提取率的影響Fig.5　Effect of extraction times on total phenolic acids extraction rate

2.2丁香葉總酚酸提取工藝優(yōu)化

2.2.1數(shù)學(xué)模型的建立與檢驗基于單因素實驗，采用響應(yīng)面法對丁香葉總酚酸的提取工藝進行優(yōu)化，以乙醇濃度（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）、液料比（D）為自變量，丁香葉總酚酸提取率（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken的實驗設(shè)計原理，得出丁香葉總酚酸提取率的四因素三水平的實驗設(shè)計及結(jié)果（見表2）。

采用Design expert 8.0.6統(tǒng)計軟件，以丁香葉總酚酸提取率為響應(yīng)值，對表2數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，各影響因子對響應(yīng)值的影響可得出下列函數(shù)關(guān)系：

對該模型進行顯著性檢驗，得方差分析表（表3）由表3可知，方程總模型和方程的二次項p=0.0172，表明該模型顯著；回歸失擬項p＞0.05，表明未知因素對該實驗的影響較少。總模型和方程的二次項對丁香葉總酚酸提取率的影響是顯著性較好。方程的一次項因素C是顯著的，A、B、D的p＞0.05，表明其對總黃酮提取率的影響不顯著，可忽略［16-18］。各因素的F值可以反映出其對實驗指標的重要性，F(xiàn)值越大，表明對實驗結(jié)果的影響越大，即重要性越大。各因素對丁香葉提取率的影響排序為：提取時間＞乙醇濃度＞液料比＞提取溫度。

表2　丁香葉總酚酸提取響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2　Process variables and levels in response surface Design arrangement and experimental response values

表3　方差分析結(jié)果Table 3　Analysis of variance for quadric regression model

2.2.2丁香葉總酚酸提取率的響應(yīng)面分析響應(yīng)面圖是響應(yīng)值對各實驗因素所構(gòu)成的三維空間曲面圖，可直觀的反映各實驗因素的交互作用［19-21］。對響應(yīng)值進行統(tǒng)計分析，研究表明，等高線的形狀反映出交互效應(yīng)的強弱，越趨向橢圓表明交互作用越強，越趨向圓形則相反，表明交互作用越弱［22］。本實驗中各因素的交互作用均不顯著。

2.2.3丁香葉總酚酸提取工藝條件的優(yōu)化由該軟件分析后得最佳工藝條件乙醇濃度為43.55%，提取溫度為90.09℃，提取時間為96.35min，液料比25.2∶1（mL/g），提取次數(shù)為2次。為了能讓丁香葉總酚酸的提取更加便捷，可取最優(yōu)條件為乙醇濃度44%，提取溫度為90℃，提取時間為96min，液料比25.2∶1（mL/g）。在此條件下經(jīng)過驗證得到總酚酸的實際平均提取率為（1.642±0.23）mg/g，與理論預(yù)測值1.66mg/g接近，表明該工藝優(yōu)化合理。

3　結(jié)論

將響應(yīng)面分析法用于丁香葉總酚酸提取工藝參數(shù)的優(yōu)化，確定的最佳提取工藝為乙醇濃度44%、提取溫度90℃、提取時間96min、液料比25.2∶1（mL/g）、提取次數(shù)為2次。在此條件下丁香葉總酚酸提取率為（1.642±0.23）mg/g，優(yōu)化得到的最佳提取工藝是提取丁香葉總酚酸化合物的有效途徑，為進一步開發(fā)食品添加劑和功能性食品提供了可靠依據(jù)。

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Optimization of extraction process of total phenolic acids from Syringa oblate Lindl.leaves by response surface methodology

WU Yan，SHENG Zun-lai，GAO Ling-fei，CHEN Jian-qing，LI Yan-hua*
（College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Total phenolic acids extraction from Syringa oblate Lindl.leaves was performed using the ethanol reflux extraction.Response surface methodology（RSM），based on a three level，four variable Box-Behnken design（BBD），was employed to obtain the best possible combination of ethanol concentration，extraction temperature，extraction time，and water to the raw material ratio for maximum total phenolic acids extraction. The optimum extraction conditions were as follows：ethanol concentration of 44%，extraction time of 96min，extraction temperature of 90℃，and the ratio of water to raw material of 25.2∶1（mL/g），extraction times of 2. Under these conditions，the experimental yield was（1.642±0.23）mg/g.The extraction process obtained by response surface methodology was stable and reasonable，accurate and reliable.It was a feasible method to extract the total phenolic acids from Syringa oblate Lindl.Leaves.

Syringa oblate Lindl.leaves；total phenolic acids；response surface methodology（RSM）；extraction process

TS201.1

B

1002-0306（2015）02-0286-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.053

2014－04－14

吳燕（1991-），女，碩士研究生，研究方向：動物藥學(xué)。

李艷華（1972-），女，博士研究生，教授，主要從事病原微生物耐藥性及新獸藥研發(fā)。

黑龍江省留學(xué)歸國基金（LC2013C05）。