檳榔提取物不同部位的抗氧化性比較及成分研究

張　丹，李　丹，許啟泰，康文藝（河南大學(xué)中藥研究所，河南開(kāi)封475004）

檳榔提取物不同部位的抗氧化性比較及成分研究

張丹，李丹，許啟泰，康文藝*
（河南大學(xué)中藥研究所，河南開(kāi)封475004）

采用DPPH法、ABTS法和FRAP法3種測(cè)定法對(duì)檳榔提取物體外抗氧化活性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，并分析其總多酚與總黃酮含量與抗氧化活性的關(guān)系。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，檳榔提取物乙酸乙酸部位和正丁醇部位均有一定的抗氧化活性。其中乙酸乙酯部位清除DPPH自由基和ABTS+自由基的能力（IC50=14.60、2.04μg/mL）和還原Fe3+的能力（TEAC= 4762.99μmol/g）均強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照BHT（DPPH方法：IC50=24.49μg/mL；ABTS方法：IC50=6.56μg/mL；FRAP方法：TEAC= 2503.17μmol/g），正丁醇部位清除DPPH自由基和ABTS+自由基的能力（IC50=44.32、7.62μg/mL）和還原Fe3+的能力（TEAC=1587.42μmol/g）均弱于陽(yáng)性對(duì)照BHT，且乙酸乙酯部位總多酚和總黃酮含量均大于正丁醇部位?？梢?jiàn)，乙酸乙酯部位清除DPPH自由基、ABTS+自由基及還原Fe3+的能力可能與其總多酚、總黃酮含量高有關(guān)。

檳榔，抗氧化活性，總多酚，總黃酮

檳榔（Areca catechu L.）為棕櫚科檳榔屬植物，主要分布在海南、臺(tái)灣、廣東和廣西等地，是我國(guó)“四大南藥”之首。有殺蟲(chóng)、消積、行氣、利水、截瘧的功效，用于絳蟲(chóng)病、蛔蟲(chóng)病、蟲(chóng)積腹痛、積滯瀉痢、水腫腳氣、瘧疾等的治療［1］。檳榔主要化學(xué)成分有生物堿、酚類(lèi)、黃酮和皂苷等。藥理研究表明，檳榔具有驅(qū)蟲(chóng)、抗氧化、抗病原微生物、抗過(guò)敏、抗抑郁、調(diào)血脂等作用［2-5］。

目前，國(guó)內(nèi)外主要研究了檳榔不同提取物多酚含量及其抗氧化活性。Han L等［6］利用70%乙醇超聲輔助提取產(chǎn)于海南檳榔果種子多酚并測(cè)定其含量，利用紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定其清除DPPH、ABTS自由基能力及其還原能力，考察其抗氧化活性；Chavan YV等［7］利用丙酮水提取產(chǎn)于印度檳榔果實(shí)多酚、鞣酸并測(cè)定其含量，利用紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定了其清除羥基、ABTS自由基能力及其還原能力。目前，未見(jiàn)對(duì)產(chǎn)于海南檳榔果實(shí)的多酚、黃酮含量及其抗氧化活性研究。本文利用微量法測(cè)定檳榔不同提取部位清除DPPH、ABTS自由基和鐵離子還原/抗氧化（FRAP）能力，評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性，并測(cè)定其不同部位總多酚和總黃酮的含量，分析其與抗氧化活性的關(guān)系，為科學(xué)合理開(kāi)發(fā)檳榔資源，全面評(píng)價(jià)檳榔的抗氧化作用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

檳榔于2013年9月采自海南，由河南大學(xué)中藥研究所李昌勤教授鑒別為棕櫚科檳榔屬植物檳榔Areca catechu L.的果實(shí)，標(biāo)本存于河南大學(xué)中藥研究所；1，1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH） 日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社；Fe3+-三吡啶三啞嗪（TPTZ）、二丁基羥基甲苯（BHT） 比利時(shí)Acros organics公司；2，2′-連氨-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽（ABTS）

美國(guó)Fluka公司；Trolox（6-hydroloxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid）Aldrich公司；鄰苯二酚北京化學(xué)試劑公司；斐林酚試劑Merck公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品由河南大學(xué)天然藥物研究所提供，純度98%；其他試劑均為分析純。

UV-2000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)尤尼可上海儀器有限公司；電子天平梅特勒-托利多儀器有限公司；MultiskaMK3酶標(biāo)儀美國(guó)Thermo Electron公司；超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；CS-H1型混合器北京博勵(lì)陽(yáng)科技公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀德國(guó)Heidolph公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1活性成分的提取新鮮檳榔150g，洗凈切碎，用70%乙醇加熱回流2次（V/W=2∶1），每次1h，合并、過(guò)濾、濃縮得檳榔70%乙醇總浸膏。總浸膏分散于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取3～4次，每次各300mL，利用噴霧干燥得到石油醚部位（少量）、乙酸乙酯部位0.93g和正丁醇部位0.51g，乙酸乙酯部位和正丁醇部位的提取率分別為0.62%和0.34%。

1.2.2抗氧化活性的篩選

1.2.2.1DPPH方法按照文獻(xiàn)［8］，將10μL樣品溶液和175μL 200μmol/L的DPPH溶液先后加入到96微孔板中，陰暗處反應(yīng)20min后，用酶標(biāo)儀在492nm處測(cè)定吸光度。每份樣品平行操作3次，取平均值。按照公式計(jì)算清除率：

式中：Acontrol為DPPH本身在測(cè)定波長(zhǎng)的吸收度，Asample為樣品對(duì)DPPH作用后的吸收度數(shù)值（除去樣品自身吸收）。

1.2.2.2ABTS方法參照文獻(xiàn)［9］，將ABTS用蒸餾水溶解，配制成7mmol/L的溶液，與2.45mmol/L的K2S2O8溶液混合，暗處放置12h以上，使用時(shí)用甲醇稀釋使吸光度在734nm處為0.78～0.82，待用。樣品初始濃度為2.0mg/mL。取10μL樣品加入200μL ABTS自由基工作液混勻測(cè)定吸光度。每份樣品平行3次，取平均值。按照以下公式計(jì)算清除率：

式中：Acontrol為ABTS自由基本身在測(cè)定波長(zhǎng)的吸收度，Asample為樣品對(duì)ABTS自由基作用后的吸收度數(shù)值（除去樣品自身吸收）。

1.2.2.3FRAP方法參照文獻(xiàn)［10］，將樣品用甲醇配制成一系列濃度，取10μL樣品加入到96微孔板中，隨后加入200μL新鮮配制的TPTZ工作液，混勻，37℃反應(yīng)30min后，用酶標(biāo)儀在595nm測(cè)定吸光度。每份樣品平行操作3次，取平均值。若所測(cè)定樣品吸光度值超過(guò)線(xiàn)性范圍，則需要進(jìn)一步稀釋樣品。

1.2.2.4數(shù)據(jù)處理依據(jù)上述公式計(jì)算得到的清除率，用origin軟件處理，得到樣品清除DPPH自由基和ABTS自由基的半數(shù)抑制率IC50值。

1.2.3總多酚的含量測(cè)定在文獻(xiàn)［11］的基礎(chǔ)上對(duì)反應(yīng)時(shí)間和試劑體積稍做改變，準(zhǔn)確量取配制好的供試品溶液0.1mL，依次加入0.5mL蒸餾水和0.7mL的斐林酚試劑，混勻后室溫暗處放置3min，然后加入0.9mL 0.9%碳酸鈉溶液，混合均勻，室溫暗處放置90min，于765nm處測(cè)定吸光度。以吸光度（Y）對(duì)鄰苯二酚濃度（X，mg/mL）作圖，得鄰苯二酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算檳榔乙酸乙酯部位和正丁醇部位總多酚含量。

1.2.4總黃酮的含量測(cè)定參照文獻(xiàn)［11］，準(zhǔn)確量取配制好的供試品溶液0.5mL，加入蒸餾水2.5mL，搖勻；加入5%NaNO2溶液0.15mL，混勻后放置5min；加入10%AlCl3溶液0.3mL，混勻后放置6min；然后依次加入1mol/L NaOH溶液1mL和蒸餾水0.55mL，混勻后于510nm處測(cè)定吸光度。以吸光度（Y）對(duì)蘆丁濃度（X，mg/mL）作圖，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算檳榔乙酸乙酯部位和正丁醇部位總黃酮含量。

2　結(jié)果與分析

2.1對(duì)DPPH自由基的清除作用

表1　檳榔不同提取部位的抗氧化活性Table 1　Antioxidant activity of different extracts from Areca catechu L.

由表1可以看出，檳榔乙酸乙酯部位和正丁醇部位均有一定的清除DPPH自由基的能力，其中乙酸乙酯部位清除DPPH自由基的能力（IC50=14.6μg/mL）強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照品BHT（IC50=24.49μg/mL），約為BHT作用的1倍，且具有顯著性差異（p＜0.05）；正丁醇部位清除DPPH自由基的能力（IC50=44.32μg/mL）弱于陽(yáng)性對(duì)照品BHT（IC50=24.49μg/mL），約為BHT作用的0.5倍，且具有顯著性差異（p＜0.05）。

由圖1可知，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，正丁醇部位和BHT對(duì)DPPH自由基的清除率均與質(zhì)量濃度呈正量效關(guān)系，即隨著質(zhì)量濃度增加，對(duì)DPPH自由基的清除率也增大。當(dāng)質(zhì)量濃度低于27.03μg/mL時(shí)，乙酸乙酯部位對(duì)DPPH自由基的清除率與質(zhì)量濃度呈正量效關(guān)系，隨后繼續(xù)增加質(zhì)量濃度，清除率幾乎不變。在任意相同濃度下，乙酸乙酯部位對(duì)DPPH自由基的清除率均高于BHT，正丁醇部位對(duì)DPPH自由基的清除率均低于BHT。Han L等［6］評(píng)價(jià)了產(chǎn)于海南檳榔果種子清除DPPH自由基能力，結(jié)果顯示，當(dāng)提取質(zhì)量濃度為50μg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率為28.30%，而本文主要研究的是檳榔果實(shí)萃取后的各部位，當(dāng)提取質(zhì)量濃度為50μg/mL時(shí)，乙酸乙酯部位和正丁醇部位對(duì)DPPH自由基的清除率為86.32%和56.62%，經(jīng)比較分析可得出在相同提取質(zhì)量濃度下，本研究測(cè)定的乙酸乙酯部位對(duì)DPPH自由基的清除率較好。

圖1　提取物質(zhì)量濃度對(duì)DPPH自由基的影響Fig.1　Effect of mass concentration of extracts on DPPH free radical

2.2對(duì)ABTS自由基的清除作用

由表1可以看出，與陽(yáng)性對(duì)照BHT相比，乙酸乙酯部位清除ABTS+自由基的能力（IC50=2.04μg/mL）強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照品BHT（IC50=6.56μg/mL），約為BHT作用的3倍，且具有顯著性差異（p＜0.05），而正丁醇部位清除ABTS+自由基的能力（IC50=7.62μg/mL）與陽(yáng)性對(duì)照品BHT（IC50=6.56μg/mL）相當(dāng)，無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。

圖2　提取物質(zhì)量濃度對(duì)ABTS+自由基的影響Fig.2　Effect of mass concentration of extracts on ABTS+free radical

由圖2可以看出，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.19μg/mL時(shí)，乙酸乙酯部位對(duì)ABTS+自由基的清除率為2.79%，隨著其質(zhì)量濃度的增加，清除率也增大，當(dāng)質(zhì)量濃度為5.95μg/mL時(shí)，清除率已達(dá)到94.41%，質(zhì)量濃度再增加，清除率變化不大；當(dāng)質(zhì)量濃度為5.95μg/mL時(shí)，正丁醇部位對(duì)ABTS+自由基的清除率為38.80%，質(zhì)量濃度為23.81μg/mL時(shí)，清除率增加到97.21%，再增加提取物的濃度，清除率變化不大。Han L等［6］對(duì)產(chǎn)于海南檳榔果種子清除ABTS+自由基能力進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)提取質(zhì)量濃度為50μg/mL時(shí)，對(duì)ABTS+自由基的清除率為24.28%，本文測(cè)定了海南檳榔果實(shí)萃取后的各部位清除ABTS+自由基能力，當(dāng)提取質(zhì)量濃度為50μg/mL時(shí)，乙酸乙酯部位和正丁醇部位對(duì)ABTS+自由基的清除率為96.58%和95.43%，由兩次測(cè)定結(jié)果可得出乙酸乙酯部位和正丁醇部位對(duì)ABTS+自由基的清除率均較好。

2.3還原Fe3+的能力

由表1可以看出，檳榔乙酸乙酯部位和正丁醇部位均有一定的還原Fe3+的能力，其中乙酸乙酯部位還原Fe3+的能力（TEAC=4762.99μmol/g）強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照BHT（TEAC=2503.17μmol/g），且具有顯著性差異（p＜0.05），正丁醇部位還原Fe3+的能力（TEAC=1587.42μmol/g）弱于BHT，且具有顯著性差異（p＜0.05）。

2.4總多酚和總黃酮的含量

按照上述實(shí)驗(yàn)方法，繪制總多酚和總黃酮含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以吸光度（Y）對(duì)鄰苯二酚濃度（X，mg/mL）作圖，得鄰苯二酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，Y=119X-0.049（r=0.9985）；以吸光度（Y）對(duì)蘆丁濃度（X，mg/mL）作圖，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，Y=9.309X-0.004（r=0.9995），以此計(jì)算檳榔乙酸乙酯部位和正丁醇部位中總多酚和總黃酮的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　檳榔不同提取部位總多酚與總黃酮的含量Table 2　Contents of total phenols and total flavonoids of different extracts from Areca catechu L.

由表2可以看出，檳榔乙酸乙酯部位和正丁醇部位具有一定量的多酚和黃酮成分，其中乙酸乙酯部位總多酚和總黃酮含量均大于正丁醇部位，且兩個(gè)部位的總黃酮含量均大于總多酚，具有顯著性差異（p＜0.05）。

綜上所述，乙酸乙酯部位清除DPPH自由基和ABTS+自由基的能力以及還原Fe3+能力均強(qiáng)于正丁醇部位，且乙酸乙酯部位總多酚和總黃酮含量比正丁醇部位含量較高。可見(jiàn)，乙酸乙酯部位清除DPPH自由基、ABTS+自由基及還原Fe3+的能力可能與其總多酚、總黃酮含量高有關(guān)。隨著總多酚和總黃酮含量的增加，抗氧化能力增強(qiáng)。

3　結(jié)論

檳榔乙酸乙酯部位清除DPPH自由基和ABTS+自由基的能力以及還原鐵離子的能力（IC50=14.60、2.04μg/mL，TEAC=4762.99μmol/g）均比正丁醇部位強(qiáng)（IC50=44.32、7.62μg/mL，TEAC=1587.42μmol/g），且強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照BHT（DPPH方法：IC50=24.49μg/mL；ABTS方法：IC50=6.56μg/mL；FRAP方法：TEAC=2503.17μmol/g），其自由基清除能力及還原能力與其總多酚、總黃酮含量的相關(guān)性高。

檳榔乙酸乙酯部位有較強(qiáng)的抗氧化能力，具有開(kāi)發(fā)天然抗氧化性物質(zhì)的潛力，這為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用檳榔資源、深入挖掘其在食品、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了一定的參考價(jià)值。

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Comparative study of antioxidant activity and ingredient in different parts of Areca catechu L.extract

ZHANG Dan，LI Dan，XU Qi-tai，KANG Wen-yi*
（Institute of Natural Medicines，Henan University，Kaifeng 475004，China）

The antioxidant activity of Areca catechu L.was evaluated by three methods：DPPH radical scavenging assay，ABTS+radical scavenging assay and ferric reducing antioxidantpower（FRAP）assay.The relation of the antioxidant activity with the contents of total polyphenols and total flavonoids was studied.The results showed that ethyl acetate extract and n-butanol extract of A.catechu had certain antioxidant activity.The ethyl acetate extract had higher DPPH and ABTS+radical scavenging activity（IC50was 14.60 and 2.04μg/mL），and ferric reducing antioxidant power（TEAC was 4762.99μmol/g）than that of BHT（DPPH：IC50was 24.49μg/mL，ABTS：IC50was 6.56μg/mL and FRAP：TEAC was 2503.17μmol/g，respectively）.The n-butanol extract had lower DPPH and ABTS+radical scavenging activity（IC50was 44.32 and 7.62μg/mL），and ferric reducing antioxidant power（TEAC was 1587.42μmol/g）than that of BHT.The contents of total polyphenols and total flavonoids of ethyl acetate extract were higher than that of n-butanol extract.Thus it could be seen that the DPPH and ABTS+radical scavenging activity and ferric reducing antioxidant power of ethyl acetate extract might be related to its high total polyphenols and total flavonoids content.

Areca catechu L.；antioxidant activity；total polyphenols；total flavonoids

TS201.2

A

1002-0306（2015）02-0102-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.013

2014－02－24

張丹（1988-），女，在讀碩士研究生，研究方向：中藥活性成分研究。

康文藝（1971-），男，博士研究生，教授，研究方向：中藥活性成分及新藥研究。

海南省科技廳（瓊農(nóng)科：2013065）。