響應曲面優化檸檬酸淀粉清料發酵培養基

喬　君，趙祥穎，馬欽元，張家祥，韓延雷，劉建軍，*（.山東省食品發酵工程重點實驗室，山東濟南5003；.濰坊英軒實業有限公司，山東濰坊5003）

響應曲面優化檸檬酸淀粉清料發酵培養基

喬君1，趙祥穎1，馬欽元2，張家祥1，韓延雷1，劉建軍1，*
（1.山東省食品發酵工程重點實驗室，山東濟南250013；2.濰坊英軒實業有限公司，山東濰坊250013）

運用響應面法對淀粉清料發酵生產檸檬酸的培養基進行了優化。根據單因素實驗結果，利用Plackett-Burman設計對相關因素進行評估并篩選出具有顯著效應的3個因素：玉米漿、尿素、pH。用最陡爬坡實驗逼近以上3個因子的最大響應區域后，采用Box-Behnken設計以及響應面分析法，確定其最佳培養基：玉米漿5.15g/L、尿素1.83g/L、初始pH=4.15、磷酸氫二鉀0.4g/L、硫酸鎂0.2g/L。在優化培養基條件下，淀粉清料發酵檸檬酸產量為147.52g/L，比優化前提高了約12.19%，與玉米粉帶渣發酵相比，檸檬酸平均產量和轉化率都提高了約10%，發酵殘糖降低了約88%。

檸檬酸，清料發酵，培養基優化，響應曲面

檸檬酸，又名枸櫞酸，其具有令人愉悅的酸味，入口爽快，無后酸味，安全無毒，主要作為酸味劑應用于食品、飲料行業且在醫藥、化工、環保、化妝品、紡織、印染、建筑等領域也有廣泛應用［1-2］。

我國自20世紀60年代開始，經過幾代人的不懈努力，培育出以薯干粉為原料的黑曲霉生產菌株，與國外酵母菌清料生產檸檬酸相比具有適應性強（能采用山芋干、玉米、木薯、大米等多種淀粉質原料）、遺傳性能穩定、產酸高等優點，開創了具有中國特色的檸檬酸帶渣發酵工藝［3］。該工藝能很好的配合鈣鹽法分離技術。但是隨著經濟發展環保意識的增強，人們意識到鈣鹽法分離技術操作過程復雜、生產成本高，產生大量廢渣、廢氣和廢水，嚴重污染環境。而采用色譜法提取技術則能基本實現檸檬酸行業零污染［4］。但是，色譜法對料液清潔度要求很高，否則，極易造成色譜柱污染，降低提取效率，增加生產成本。我國檸檬酸生產采用帶渣發酵，發酵液成分復雜，不適用于色譜法分離技術。因此，我國亟待研發檸檬酸清料發酵技術，既保留了我國檸檬酸發酵的眾多優點，又能實現“零污染”。清料發酵具有培養基成分均一穩定，減少了發酵過程中副產物的產生，減輕了后期提取的負荷，也減少了培養基中不參加代謝雜質的能源消耗［5-7］。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

黑曲霉（Aspergillus niger）濰坊英軒實業有限公司；鄰苯二甲酸氫鉀天津化學試劑有限公司，分析純；α-高溫淀粉酶20000酶活/mL，濰坊英軒生物技術有限公司；碘化鉀天津化學試劑有限公司，分析純；氫氧化鈉萊陽化工有限公司，分析純；碘天津化學試劑有限公司，分析純；淀粉市售；麩皮市售；玉米漿濰坊英軒生物技術有限公司；瓊脂海南省青葛瓊脂廠；尿素天津化學試劑有限公司，分析純；MgSO4·7H2O天津同鑫化工廠，分析純。

SBA-40C型葡萄糖測定儀山東省科學院生物研究；THZ-C型生化培養箱江蘇太倉市實驗設備廠；PHS-3C型便攜式pH計上海雷磁儀器廠；HYG-A型回轉式恒溫調濕搖瓶柜上海新星自動化控制設備成套廠；HH-S型恒溫水浴鍋江蘇金壇縣國華儀器廠；CJ型超凈工作臺蘇州凈化設備廠；YXQSG41280型蒸汽消毒器無錫市第二醫療器械廠；JY2002型電子天平上海儀器儀表有限公司。

1.2培養基

1.2.1察氏培養基NaNO33g/L，KCl 0.5g/L，FeSO40.01g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，蔗糖30g/L，瓊脂20g/L，pH6.7，121℃滅菌15min。

1.2.2麩曲培養基取市售、無霉變麩皮過篩去除細粉（50目篩），稱取30g麩皮，按麩皮∶水=1∶1混合均勻，加入500mL三角瓶中，于121℃滅菌30min。

1.2.3發酵培養基

1.2.3.1淀粉液化［8］自來水與淀粉按質量比4∶1的比例混合，95℃保溫并不斷攪拌，并加入α-高溫淀粉酶，恒溫20～30min，用碘指示劑檢驗不變藍，冷卻，回復原來體積，得到淀粉液化液。

1.2.3.2發酵培養基淀粉液化液中分別加入玉米漿5g/L，尿素0.5g/L，硫酸鎂0.05g/L，磷酸氫二鉀0.02g/L。

1.3培養方法

冰箱保存的斜面菌種轉接于察氏培養基上，37℃培養3d長滿大量黑色孢子，取一環斜面種子接種于麩曲瓶中，37℃培養約7d。取適量培養好的麩曲接至適量無菌水中，充分混勻，調整孢子濃度為1× 108個/mL，將適量孢子懸液接入裝有50mL發酵培養基的500mL搖瓶中，37℃，200r/min振蕩培養96h，過濾去菌體，取適當清液測定總酸。

1.4分析方法

1.4.1總酸測定方法［9］用0.1429mol/L的NaOH溶液滴定，所消耗的NaOH毫升數即為發酵液中檸檬酸的含量。

1.4.2總糖測定［10-11］初始總糖：發酵液接種后，經水解，按斐林氏定糖法測定。殘糖：發酵結束后，發酵液經水解，按斐林氏定糖法測定。

1.4.3葡萄糖濃度的測定SBA-40D生物傳感分析儀測定。

1.5實驗設計

1.5.1主要因素篩選本文經前期單因素實驗發酵培養基的最佳組分比例為：初糖150g/L、玉米漿6g/L、尿素1g/L、初始pH=3.0、磷酸氫二鉀0.4g/L、硫酸鎂0.2g/L，檸檬酸產量為128g/L，轉化率為85.3%。在此基礎上，采用Minitab 15軟件，選用N=12的6因素的Plackett-Burman［12］實驗設計，考察各因素對檸檬酸產量影響的顯著性。

1.5.2最陡爬坡實驗最陡爬坡法以實驗值變化的梯度方向為爬坡方向，根據各因素效應值的大小確定變化步長，能快速、經濟的逼近最佳區域［13］。

1.5.3響應面分析法根據Box-behnken的中心組合實驗設計原理，進行3因素3水平的響應面分析實驗，使用Minitab 15軟件對實驗數據進行二次回歸擬合。15個實驗點可以分為兩類：其一是析因點，自變量取值在X1、X2、X3所構成的三維頂點，共有12個析因點；其二是零點，為區域的中心點，零點實驗重復3次，用以估計實驗誤差［13］。

以篩選出的玉米漿、尿素、pH3個主要因素為自變量，以檸檬酸產量為響應值，根據最陡爬坡實驗的結果確定實驗中心和水平，實驗因素與水平的選取見表1。

表1　響應面分析實驗因素與水平Table 1　Factors and level value of response surface analysis

表2　N=12的Placket-Burman實驗設計及結果Table 2　Placket-Burman design and responding value of N=12

2　結果與討論

2.1確定影響檸檬酸產量的主要因素

Plackett-Burman實驗設計是一種二水平的多因子設計方法，能用最少實驗次數從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個因素。根據前期對黑曲霉清料生產檸檬酸發酵培養基的初步優化，選用N=12的Plackett-Burman實驗設計，對初始總糖（X1）、玉米漿（X2）、尿素（X3）、pH（X4）、磷酸氫二鉀（X5）、硫酸鎂（X6）6個因素進行考察，每個因素分別取兩個水平（-1，+1），響應值為檸檬酸產量，實驗設計及檸檬酸產率結果見表2和表3。

表3　各因素效應值及顯著性分析Table 3　Effect of different factors

采用Minitab15對實驗結果進行分析，各因素效應結果見表3。從表3可以看出，實驗選取的6個因素對檸檬酸產率影響的顯著性順序為：玉米漿、尿素、pH、初始總糖、磷酸氫二鉀和硫酸鎂。其中玉米漿的可信度在95%以上，具有顯著性影響（p＜0.05），尿素和pH對實驗的影響較X1、X5、X6大，所以選取玉米漿、尿素、pH三個因素做爬坡實驗。

2.2最陡爬坡實驗

由Plackett-Burman實驗可知，玉米漿、尿素、pH這3個因素對檸檬酸的產量影響較大，其中尿素和pH為正效應，應增加，玉米漿為負效應，應降低。根據這三個因素效應大小的比例設定它們的變化方向以及步長，實驗設計及結果見表4。

表4　最陡爬坡實驗設計及結果Table 4　Experimental design and results of steepest asent

從表4中可以看出，沿著變化方向，檸檬酸的產量呈現先上升后后下降的趨勢，第三步時的檸檬酸產量達到最高值（142.11g/L），因此選擇該步對應的變量因子作為下一步Box-Behken設計的中心點。

2.3響應面分析設計

2.3.1二次回歸模型擬合及方差分析根據Box-Behnken的中心組合設計原理，利用Minitab 15軟件設計三因素三水平的響應面實驗，以玉米漿、尿素、pH3個因素為自變量，以檸檬酸產量為響應值，中心組合響應面實驗設計及結果見表5。

以檸檬酸的產量為響應值，根據表5的實驗結果，用Minitab軟件進行多元回歸分析，根據實驗結果，通過Minitab軟件獲得擬合方程：

表5　中心組合響應面設計及結果Table 5　Response surface central composite design and corresponding response

回歸方程的方差分析及模型顯著性分析結果見表6、表7。

表6　回歸方程的方差分析Table 6　Analysis of variance for the regression equation

表7　回歸方程系數顯著性檢驗表Table 7　The significance test for the regression equation

從表6中可以看出，模型回歸高度顯著（p＜0.01），R2=0.9645，失擬項不顯著（p=0.2603），說明該模型與實際實驗擬合很好，調整后的R2為0.9005，即表明模型可以解釋90.05%的發酵產檸檬酸水平的變化，進一步說明了回歸方程的擬合程度較好。方程一次項、二次項的影響極顯著（p＜0.01），整體交互作用不顯著（p=0.649）。表7中p值表明，此處X1X3（p=0.251）、X2X3（p=0.799）不顯著，且X1X2（p=0.933）也是不顯著的，此數據進一步驗證表6中“交互作用”項不顯著的結果。

由響應面回歸分析和回歸方程擬合可以繪出響應面圖形，見圖1～圖3。

圖1　Y=f（X1，X2）的響應面立體分析Fig.1　Surface layer Analysis of X1and X2

圖2　Y=f（X1，X3）的響應面立體分析Fig.2　Surface layer Analysis of X1and X3

圖3　Y=f（X2，X3）的響應面立體分析Fig.3　Surface layer Analysis of X2and X3

2.3.2最佳培養基成分的確定為了求得培養基最佳的濃度，對所得的回歸擬合方程分別對各自的變量求一階偏導數，并令其為0可得到曲面的穩定點，即最大點：

以上代碼值換算可得：X1=5.15g/L，X2=1.83g/L，X3=4.15，在此條件下理論預測檸檬酸產量可達148.3g/L。2.3.3最佳發酵培養基的驗證為了確定建立的模型與實驗結果是否相符，根據以上實驗結果確定的主要影響因素濃度來配制發酵培養基，進行3組平行實驗，并于玉米粉帶渣發酵實驗結果進行對比，實驗結果見表8。

表8　檸檬酸淀粉清料發酵與帶渣發酵對照Table 8　The contrast between Clarifying and unrefined starch fermentation

黑曲霉產檸檬酸的平均產量為147.52g/L，與預測值接近，同優化前產量128g/L相比，提高了約12.19%。表明所得的模型有一定的實踐指導意義。與帶渣發酵實驗結果相比，檸檬酸產量和轉化率都提高了約10%，發酵殘糖降低了約88%。這可能是由于玉米渣中含有部分不能被黑曲霉利用的多糖所致。另一方面，清料發酵的溶氧效果增強等原因造成的。

3　結論與討論

通過單因素實驗和響應面實驗分析對淀粉液化清液的發酵培養基組成和培養條件進行了研究，確定了最佳發酵培養基和較優培養條件：最佳培養基組成為：玉米漿5.15g/L、尿素1.83g/L、初始pH=4.15、磷酸氫二鉀0.4g/L、硫酸鎂0.2g/L。在最優培養基條件下，黑曲霉產檸檬酸的平均產量為147.52g/L，同優化前產率128g/L相比，提高了約12.19%。說明了響應面實驗的有效性。與玉米粉帶渣發酵相比，檸檬酸產量和轉化率都提高了約10%，發酵殘糖降低了約88%。

淀粉清料發酵生產檸檬酸技術，使檸檬酸提取工序的色譜分離技術的廣泛使用成為可能，從而實現檸檬酸行業的零污染［3］。此外，清料發酵還可以提高玉米和菌絲體附加值，優化發酵工藝控制等，從而實現清潔高效生產。本研究主要采用搖瓶發酵的方法，很多因素（如溶氧、轉速等）難以有效控制，不能充分發掘淀粉清料發酵的潛力，對于清料發酵的放大以及相關酶學性質，有待于進一步的研究，最終能夠工業化生產奠定基礎。

［1］Gurpreet Singh Dhillon，Satinder Kaur Brar，Mausam Verma，et al.Recent Advances in Citric Acid Bio-production and Recovery［J］.FoodandBioprocessTechnology，2011，4（4）：505-529.

［2］Ambati P，Ayyanna C.Optimizing medium constituents and fermentation conditions for citric acid production from palmyra jaggery using response surface method［J］.World Journal of Microbiology&Biotechnology，2001，17：331-335.

［3］周永生，滿云.我國檸檬酸行業的產業化現狀及可持續發展［J］.生物加工過程，2010，8（6）：73-76.

［4］韓德新，高年發.減少CO2排放的檸檬酸生產新工藝［J］.發酵科技通訊，2009，38（3）：1-4.

［5］張博雅，王云峰.中國玉米深加工生產發展現狀［J］.河北北方學院學報：自然科學版，2008，24（4）：28-31.

［6］曹健，殷蔚申.黑曲霉幾丁質和殼聚糖的研究［J］.微生物學報，1995，22（4）：200-203.

［7］婁永江.從檸檬酸廠廢菌絲體中提取殼聚糖的研究［J］.浙江海洋學院學報：自然科學版，1999，18（2）：129-132.

［8］S Anwar，S Ali，A A Sardar.Citric acid fermentation of hydrolysed raw starch by Aspergillus niger IIB-A6 in stationary culture［J］.Sindh Univ Res Jour（Sci Ser），2009，41（1）：1-8.

［9］Xiao-Yan Liu，Zhe Chi，Guang-Lei Liu，et al.Both Decrease in ACL1 Gene Expression and Increase inICL1Gene Expression in Marine-Derived YeastYarrowia lipolytica Expressing INU1

Gene Enhance Citric Acid Production from Inulin［J］.Mar Biotechnol，2013，15：26-36.

［10］Ana María Torrado，Sandra Cortés，José Manuel Salgado，et al.Citric acid production from orange peel wastes by solid-state fermentation［J］.Brazilian Journal of Microbiology，2011，42：394-409.

［11］GS Dhillon，SK Brar，M Verma，et al.Enhanced solid-state citricacidbio-productionusingapplepomacewaste through surface response methodology［J］.Journal of Applied Microbiology，2011，110：1045-1055.

［12］Suzelle B，Jin W.Response surface optimization of medium components for citric acid production by Aspergillus niger NRRL 567 grown in peat moss［J］.Bioresource Technology，2008，99：368-377.

［13］郝學財，余曉賦，劉志鈺，等.響應面方法在優化微生物培養基中的應用［J］.食品研究與開發，2006（27）：38-41.

［2］Mohamed Elleuch，DorotheaBedigian，OlivierRoiseux，et al. Dietary fibre and fibre-rich by-products of food processing：characterization，technologicalfunctionalityand commercialapplications：a review［J］.Food Chemistry，2010（6）：2-8.

［3］魏煒，李杰，王華.汁用甜橙果肉膳食纖維研究進展［J］.食品工業科技，2013，34（10）：281-385.

［4］吳笑臣，王科軍.鐘金蓮，等.響應面法優化臍橙渣中水溶性膳食纖維提取工藝［J］.食品科學，2012，33（4）：109-114.

［5］毛慧君，文良娟，李英，等.發酵法從西番蓮果渣中制備膳食纖維的研究［J］.食品科學，2010，31（3）：193-197.

［6］曾祥燕，趙良忠.桔子皮渣水溶性膳食纖維提取工藝的優化［J］.食品與械，2012，28（1）：193-196.

［7］Fouad Abdulrahman Hassan，Amin Ismail，Azizah Abdul Hamid，et al.Characterization of fiber-rich powder and antioxidant capacity of Mangifera pajang Kort fruit peels［J］.Food Chemistry，2011，126（1）：283-288.

［8］李鳳英，劉素穩，趙希艷.葡萄皮可溶性膳食纖維飲料的研制［J］.食品研究與開發，2013，34（8）：56-59.

［9］于麗娜，楊慶利，畢潔，等.花生殼水溶性膳食纖維提取工藝的研究［J］.現代化工，2008，28（2）：324-327.

［10］黃群，楊萬根，余佶，等.超聲波輔助堿法提取杜仲籽粕可溶性膳食纖維的工藝優化［J］.食品科學，2013，34（22）：70-74.

［11］杜彬，李鳳英，范長軍，等.響應面法優化葡萄皮渣中可溶性膳食纖維的酸法提取工藝［J］.食品科學，2011，32（22）：128-134.

［12］羅章，孫術國，方軍，等.楊梅渣膳食纖維提取工藝［J］.食品與發酵工業，2011，37（3）：215-219.

［13］李昊虬，王國澤，孫曉宇.響應面法優化河套蜜瓜水溶性膳食纖維提取工藝的研究［J］.食品工業科技，2012，7：254-259.

［14］花旭斌，楊麗瓊.響應面法優化酸法提取蕨菜中水溶性膳食纖維的工藝研究［J］.安徽農業科學，2011，39（35）：21775-21777.

Response surface optimization of medium components for citric acid production using clarifying solution of starch

QIAO Jun1，ZHAO Xiang-ying1，MA Qin-yuan2，ZHANG Jia-xiang1，HAN Yan-lei1，LIU Jian-jun1，*
（1.Food&Fermentation Engineering Key Lab of Shandong Province，Ji’nan 250013，China；2.Weifang Ensign Industry Co.Ltd.，Weifang 250013，China）

Response surface methodology（RSM）had been employed to optimize the clarifying starch medium for citric acid production by Aspergillus niger.Firstly，according to the results of amono-factor experiment，a Plackett-Burman design was used to investigate the effects of different factors in the ferment medium，with the three statistically significant factors being identified as：corn steep liquor，urea and pH.Secondly，the steepest ascent procedure wasemployed to define the optimal response region for these three factors.Finally，the Box-Behnken method was employed to design the reaction system.The results of the experiments were analyzed by RSM with Minitab15.0 software.The optimal fermentation medium for production of citric acid consisted of the following（g/L）：corn steep liquor 5.15g/L，urea 1.83g/L，pH4.15，MgSO40.2g/L，K2HPO40.4g/L.The average yield and conversion rate of citric acid，compared with unrefined starch culture，improved about 10%，meanwhile，the total residual sugar reduced about 88%.

citric acid；clarifying fermentation；media optimization；response surface methodology

TS201.3

A

1002-0306（2015）02-0231-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.041

2014－05－26

喬君（1985-），男，碩士研究生，助理工程師，研究方向：生物發酵。

劉建軍（1962-），男，博士研究生，研究員，研究方向：生物發酵。

山東省自主創新專項（2012CX20505）。