篩選具有抑制引起腹瀉致病菌黏附功能的益生菌

薛超輝，張蘭威，張迎春，單毓娟，王淑梅，李洪波（哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱150090）

篩選具有抑制引起腹瀉致病菌黏附功能的益生菌

薛超輝，張蘭威*，張迎春，單毓娟，王淑梅，李洪波
（哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱150090）

篩選能夠抑制引起腹瀉致病菌黏附的益生菌，并且對其適應腸道環境：耐酸、耐膽鹽和黏附性能進行評價。從中國西部地區傳統發酵食品以及人類糞便樣品中分離的14株益生菌作為篩選菌株。對這14株益生菌進行抑制致病菌黏附的篩選，最終篩選出7株使致病菌黏附數量降低到1.5×104CFU/mL的益生菌進行耐受腸道環境能力評價。實驗結果顯示這7株益生菌在pH2的條件下處理90min后存活的益生菌依然能夠達到107CFU/mL左右，在0.3%的膽鹽環境中處理2h后菌數降低到原來的百分之一，單層細胞上黏附的益生菌數J5、G15和F0533能夠達到106CFU/mL，顯示出了較強的黏附能力。經過綜合分析篩選出F0533、IN4125、G15、J5和M7益生菌，經16S rDNA基因技術鑒定分別為Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus casei和Lactobacillus paracasei。

益生菌，沙門氏菌，抑制粘附，耐酸耐膽鹽

益生菌是指一類活著的微生物，當人類使用足夠的量時就會在腸道中存活，而且對人體產生有益的影響。1907年梅切尼科夫提出“喝酸乳可以長壽不老學說”，19世紀30年代田稔博士發現了可以活著到達小腸的養樂多菌，并對其功效進行了深入的研究后，顯示了乳酸菌并不僅僅只是用來發酵乳品的細菌，而是有益于腸道菌群平衡、對于人類健康有幫助的菌種，這種對人類健康有益的細菌被稱為益生菌［1-2］。自90年代初以來，形形色色的“益生菌”類保健品風靡了整個世界。與此同時，“益生菌”的研究也已成為國際上的熱門研究課題。何謂益生菌？益生菌來源于希臘字母“probios”為生命的意思，益生菌的歷史可以追溯到人類歷史初期，希臘人和古羅馬人已經開始食用奶酪和發酵乳制品，特別是給孩子和康復期的病人食用［3］。

腹瀉是發展中國家導致兒童死亡的最主要原因，腹瀉除了直接引起健康問題外，還引起人體營養失調，生長速度減緩等問題。隨著近幾年來診斷技術的發展，人們開始研究引起腹瀉的原因，進而對引起腹瀉的機制更深入的了解［4-5］。引起嬰幼兒腹瀉的主要致病菌包括：大腸埃希氏菌、志賀氏菌、彎曲桿菌、弧菌和沙門氏菌。輪狀病毒依然是引起嬰兒腹瀉的主要原因，大約占到總腹瀉的20%，然而整個致病菌依然占主要地位，大腸桿菌（11%）、彎曲桿菌（7%）、志賀氏菌（5%）被認為是引起腹瀉最常見的致病菌。所以抑制引起腹瀉的致病菌將能夠有效的抑制腹瀉的發生，致病菌引起腹瀉的過程包括黏附、生長和侵入等過程，抑制致腹瀉致病菌的益生菌的主要篩選指標是抑制致病菌生長和黏附［6］。

本文將篩選能夠抑制引起腹瀉致病菌的益生菌，篩選能夠抑制致病菌黏附的益生菌菌株。益生菌進入腸道定植的過程中要經受胃酸低pH環境，益生菌活性將會受到很大損失，在小腸中存在著一定濃度的膽鹽，益生菌活性也會遭到損失，因此益生菌的耐酸和耐膽鹽能力是其益生功能的重要指標。將篩選出的益生菌進行耐酸、耐膽鹽實驗以確定益生菌適應腸道環境的性能。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

供試菌株本實驗室保存共44株（從傳統發酵乳和人體腸道中分離純化），選取L.GG菌株為參照進行篩選，將益生菌分別接種于MRS、M17和TPY液體培養基中，在37℃培養箱中厭氧培養24h，活化3代；致病菌指標菌沙門氏菌（Salmonella ATCC14028），沙門氏菌接種于TSB培養基中活化3代；HT-29細胞

按常規傳代培養于含10%小牛血清的RPMI-1640、100U/mL鏈霉素和100U/mL鏈霉素細胞培養液中，于CO2培養箱（5%CO2，95%空氣）中37℃培養，每48h換培養液一次，長成單層后傳代接種于細胞培養板中，于5%CO2，95%空氣，37℃恒溫培養，48h后進行黏附性實驗。

ABI2720型PCR儀美國ABI公司；SW-CJ-1D型無菌操作臺蘇州凈化設備有限公司；LDZX-40AI型高壓滅菌鍋上海申安醫療器械廠；GL-10LM型離心機星科離心機有限公司；LRH-250型生化培養箱上海一恒科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1篩選具有抑制致病菌黏附功能的益生菌根據Kamini等提供的方法測定益生菌抑制致病菌黏附的能力［8］。將分離出的益生菌菌株在MRS培養基中37℃厭氧培養24h，致病菌在其培養基中37℃培養。HT-29細胞按常規傳代培養于含10%小牛血清的RPMI-1640、100U/mL鏈霉素和100U/mL鏈霉素細胞培養液中，于CO2培養箱（5%CO2，95%空氣）中37℃培養，每48h換培養液一次，長成單層后傳代接種于細胞培養板中后進行黏附性實驗。

將長成單層24孔組織細胞培養板（約1×105CFU/ mL）中加入200μL×108CFU/mL的益生菌-RPMI-1640混合液和200μL濃度為1×107CFU/mL的致病菌-RPMI-1640混合液，只加入致病菌-RPMI-1640混合液作為對照組，將24孔細胞培養板在5%CO2，95%空氣的CO2培養箱中37℃培養2h，之后將益生菌菌液移除，用緩沖溶液PBS清洗三次。將致病菌菌液移出之后加入1mL含有Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）濃度為0.5%的PBS處理5min。然后用緩沖溶液PBS沖洗三次，用1mL的蒸餾水溶解，連續稀釋后用BHI培養基進行計數。

1.2.2益生菌耐受胃酸能力測定參考Mishra等實驗方法對益生菌進行耐酸性實驗［9-10］。益生菌在MRS液體培養基中活化3代，使液體培養基中菌的濃度達到109CFU/mL。取100μL的菌液接種于9.9mL用4mol/L鹽酸酸化到pH1.5、2.0和2.5的液體培養基和未酸化的培養基中（作為對照），37℃處理90min，之后將樣品稀釋不同的梯度，用瓊脂平板傾注法在厭氧培養箱中37℃培養48h后計數，對比處理前后數活菌數的變化。

1.2.3益生菌耐受腸液膽鹽能力測定參考Ruiz-Moyano等實驗方法對益生菌進行耐膽鹽實驗［11-12］?；罨瘍纱蟮囊嫔?%接種于含膽汁的液體培養基中（0.3%和0.5%牛膽汁），同時1%接種于不含膽汁的培養基中作為對照。37℃條件下處理2h前后分別計活菌數。

1.2.4篩選具有黏附能力的益生菌參考Kim等實驗方法對益生菌進行黏附實驗［13-14］。益生菌菌株在MRSC培養基中37℃厭氧培養24h，活化三代備用。將益生菌菌液10000r/min離心10min，除去上清液，收集沉淀的菌體，將菌體和RPMI-1640細胞培養基重混合，使其濃度達到108CFU/mL。將長成單層的六孔組織細胞培養板中加入1mL 1×108CFU/mL的益生菌-RPMI-1640混合液，將細胞培養板在5%CO2，95%空氣的CO2培養箱中37℃培養2h，之后將益生菌移除，用緩沖溶液PBS清洗三次除去未黏附的益生菌，之后加入含有Triton X-100的PBS使細胞溶解。用100μL的蒸餾水溶解，連續稀釋后用MRS瓊脂培養基在37℃培養箱中培養，培養48h后計算每毫升中活菌的數量。

1.2.5運用16S rDNA技術分析鑒定益生菌菌株運用16S rDNA技術分析鑒定益生菌菌株的過程如下：

益生菌基因組DNA的提?。喝√幱趯瞪L期的益生菌培養液，5000r/min離心10min。使用DNA提取試劑盒（D3350-01 Bacterial DNA Kit，OMEGA，BIO-TEK）提取益生菌的總DNA。

引物的設計：根據不同種屬的細菌的16S rDNA序列兩端的保守性設計通用引物：引物1（fD1 primer）：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，引物2（rP1primer）：ACGGTTACCTTGTTACGACTT。引物1共20bp堿基，G+C含量為50.00%。引物2共21bp堿基，G+C含量為42.86%。

PCR反應條件：PCR共50μL反應體系如下：30μL ddH2O，5μL 10×PCR反應緩沖液，4μL四種dNTP，4μL MgCl2，1μL上游引物（引物1），1μL下游引物（引物2），4μL模板DNA，1μL Taq TMDNA聚合酶。PCR反應步驟：a.94℃熱啟動變性5min。b.94℃變性30s。c.57℃退火40s。d.72℃延伸90s。e.重復步驟b、c和d達到30次。f.72℃延伸10min，使擴增產物完整。

擴增產物純度檢測：配制1%瓊脂糖凝膠，用TAE作為電泳緩沖液，制作10μL反應體系。以DL2000分子量為：200、500、800、1000、1500和2000為分子量標準，80V電壓（5V/cm）恒壓電泳，觀察凝膠條帶。

回收16S rDNA目標產物：配制1%瓊脂糖凝膠，用TAE作為電泳緩沖液，制作50μL反應體系。以DL2000分子量為標準，80V電壓（5V/cm）恒壓電泳。電泳完成后切去DNA片段，用DNA膠回收試劑盒對16S rDNA片段進行回收。

將16S rDNA目標片段轉入大腸桿菌及測序：將16S rDNA轉入到感受態大腸桿菌體內，37℃培養箱中培養24h后，挑取白色單菌落到50mL三角瓶中擴大培養。從擴大培養的菌液提取16S rDNA片段進行瓊脂糖凝膠電泳，選擇條帶較亮的擴培菌株送至上海生工進行測序。

2　結果與分析

2.1抑制致病菌黏附的益生菌的篩選

抑制致病菌黏附是益生菌抑制腹瀉發生的關鍵環節，將腸道致病菌從腸道上皮細胞黏附位點脫落，不僅能夠有效預防腹瀉的發生，還能夠降低腹瀉復發的概率。致病菌黏附到上皮細胞的結合位點是其致病的首要條件，因為只有這樣才能不被腸道的食物和流體沖走并進行后續的大量生長和定植，最終引起腹瀉。如果益生菌能夠大幅降低致病菌的黏附效果，則能夠有效地抑制腹瀉的發生［15-17］。將篩選出的14株益生菌進行抑制致病菌黏附實驗，在長成單層細胞培養板中同時加入益生菌和致病菌菌體，兩種菌競爭性黏附到細胞，通過對比加入益生菌后致病菌的黏附性能的降低幅度來篩選抑制效果好的益生菌菌株。益生菌抑制致病菌黏附的實驗結果如圖1所示。

圖1　篩選出的益生菌進行抑制沙門氏菌黏附實驗結果（x±SD，n=3）Fig.1　Results of screened probiotics inhibition of Salmonella adhesion（x±SD，n=3）

從圖1可以看出抑制沙門氏菌黏附能力比L.GG強的菌株有：G15、M7、SB5、J10、Q11、SB33、J5、F0533、F1333、F1321、IN4224和IN4125。其中G15、J5、SB33、F0533、IN4224、IN4125和M7的抑制效果最為顯著，和對照組6.5×104CFU/mL相比降低到1.0×104CFU/mL，降低了85%左右。將篩選出的7株能夠共同抑制沙門氏菌黏附的益生菌進行耐酸耐膽鹽適應腸道環境的性能評價。

2.2益生菌耐酸實驗

益生菌要進入人體定植腸道就必須經過胃酸的低酸環境，人體胃環境影響益生菌存活的主要是酸水解作用，當pH2.5時胃酸的殺菌作用就很明顯。因此，益生菌必須能夠耐受胃酸的惡劣環境存活，才能夠到達腸道定植下來，發揮益生功能。由于胃酸最低pH可能達到1.5，在一定的范圍內變化，所以選取不同pH測定益生菌的耐酸能力［18-20］。從表1可以看出益生菌在pH1.5的條件下處理90min后存活的益生菌為105～106CFU/mL左右，其中J5、IN4125、M7和F0533存活的菌數能達到106CFU/mL，M7的菌數則能達到將近107CFU/mL，和對照組正常菌數109CFU/mL相比，菌數降低了3個數量級。

表1　益生菌耐酸實驗結果（x±SD，n=3）Table 1　Effecte of gastric juice on viability of strain（sx±SD，n=3）

益生菌在pH2.0的條件下處理90min后存活的益生菌數量能達到106CFU/mL以上，其中J5和M7存活的菌數能達到將近108CFU/mL，益生菌菌數降低了2個數量級左右。益生菌在pH2.5的條件下處理90min后存活的益生菌數量達到108CFU/mL左右，菌數降低了1個數量級左右。說明篩選出的益生菌在胃酸極端的pH環境下至少能有1%的菌株生存，進入人體腸道定植，從而發揮其益生功能。

2.3益生菌耐膽鹽實驗

益生菌只有耐受腸道的膽鹽環境，才能在腸道內定植。從表2可以看出在0.3%的膽鹽環境下存活的益生菌菌數達到107CFU/mL，和對照組對比降低了1～2個數量級，數據表明篩選出的益生菌具有較強的耐受膽鹽能力，其中J5、G15、IN4125、M7和F0533的耐受能力較強，能達到107CFU/mL以上。而這些益生菌在0.5%的膽鹽環境下存活數為106CFU/mL左右，降低了2～3個數量級。

表2　不同濃度膽鹽對菌株繁殖能力的影響（x±SD，n=3）Table 2　Effecte of different concentrations of bile salt on growth of strains（x±SD，n=3）

2.4篩選黏附能力強的益生菌

經過胃酸和腸道膽鹽極端環境條件下存活的益生菌，如果要發揮益生功能需黏附到腸道上皮細胞上，因為只有這樣才能避免被腸道流體和食物沖洗掉，才能完成在腸道的定植，因此黏附性能是衡量益生菌特性非常關鍵的指標［21］。益生菌的粘附能力如圖2所示。

圖2　篩選出的益生菌黏附實驗結果（x±SD，n=3）Fig.2　Results of screened probiotics adhesion assay（x±SD，n=3）

從圖2中可以看出益生菌和上皮細胞混合2h后，對照組益生菌濃度為109CFU/mL，而黏附到上皮細胞上的益生菌數量是104～106CFU/mL左右，其中J5、G15和F0533的黏附能力比L.GG的黏附能力強，黏附到細胞上的菌數超過106CFU/mL，黏附率為0.1%，具備較強的黏附能力。

2.5通過16SrDNA鑒定益生菌菌株

最終篩選出J5、M7、IN4125、F0533和G15進行機理研究實驗，提取其總DNA并用16S rDNA引物進行PCR，得到菌株的16S rDNA，送至上海生工進行測序。將測序結果在NCBI網站上進行比對，鑒定益生菌所屬的菌屬。經過鑒定J5、M7、IN4125、F0533和G15分別為：Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus casei、Lactobacillusrhamnosus、Lactobacillusparacasei和Lactobacillus paracasei。

3　結論

從14株潛在的益生菌菌株篩選出能夠抑制致病菌黏附的益生菌，并且對篩選出來的7株益生菌耐受腸道環境進行評價，即進行耐受腸道環境及其黏附性篩選。首先對7株菌株耐酸能力評價，實驗結果顯示4株益生菌在pH2的條件下存活的益生菌能夠達到在107CFU/mL以上。耐膽鹽能力結果顯示，在0.3%的膽鹽環境下5株益生菌活菌數在能夠達到在107CFU/mL以上。用單層HT-29細胞模擬腸道環境進行益生菌黏附實驗，實驗結果顯示有3株益生菌能夠將0.1%的益生菌黏附到上皮細胞上。運用16S rDNA基因技術鑒定五株乳酸菌F0533、IN4125、G15、J5和M7分別為Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus casei和Lactobacillus paracasei。

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Screening the probiotics inhibiting the diarrhea caused by pathogens

XUE Chao-hui，ZHANG Lan-wei*，ZHANG Ying-chun，SHAN Yu-juan，WANG Shu-mei，LI Hong-bo
（School of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China）

In this study，fourteen selected Lactobacillus isolated from human intestinal and ferment milk were assessed the ability to inhibit the infection of enteropathogens.The Lactobacillus strains were screened on the basis of probiotic characteristics（i.e.，resistance to low pH and bile salts，adhesion to the human gastrointestinal tract）.By an in vitro system simulating gastric transit，it indicated that the three probiotic strains had the ability to tolerate gastroenteric environment and the adhesive capacity to HT-29 cells.It was demonstrated that the number of 7 probiotics strains could reach about 107CFU/mL after treatment of 90min in pH2 and the number of bacteria strains decreased to one percent of the original after treatment of 0.3%of the bile salt environment 2h. Adhesion of probiotics on number of J5，G15 and F0533 could reach 106CFU/mL，which showed strong adhesion ability.Among the selected strains，five selected Lactobacillus showed a high probiotic potential and could be used in health-promoting food products.After analyzing the sequence of the 16S rDNA regions of these strains，five potential probiotic F0533，IN4125，G15，J5 and M7 were Lactobacillus rhamnosus，Lactobacillus rhamnosus，Lactobacillus paracasei，Lactobacillus casei and Lactobacillus paracasei.

probiotics；Salmonella；inhibition of adhesion；resistance to low pH and bile salts

Q78

A

1002-0306（2015）02-0227-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.040

2014－05－22

薛超輝（1986-），男，博士研究生，研究方向：益生菌篩選及功能性研究。

張蘭威（1961-），男，教授，研究方向：乳制品及益生菌功能。

國家自然科學基金資助項目（30871816/C120108）。