具有共生關(guān)系的乳酸菌和酵母菌的篩選

郭倩茹，賀銀鳳（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

具有共生關(guān)系的乳酸菌和酵母菌的篩選

郭倩茹，賀銀鳳*
（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

對(duì)分離自酸馬奶酒中的9株乳酸菌和8株酵母菌存在共生作用的菌株進(jìn)行篩選。分別于各自培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的代謝產(chǎn)物，以等量的生理鹽水作為對(duì)照，測(cè)定其穩(wěn)定期的濁度值和干重值。結(jié)果表明：乳酸菌的代謝產(chǎn)物促進(jìn)的酵母菌生長(zhǎng)有12個(gè)組合，而接近一半的酵母菌代謝產(chǎn)物對(duì)乳酸菌有促進(jìn)作用。有7個(gè)組合的乳酸菌和酵母菌存在共生作用。結(jié)論是7個(gè)共生組合分別是：LAB2YST4、LAB4YST2、LAB5YST2、LAB7YST2、LAB7YST4、LAB8YST2、LAB9YST2。7個(gè)組合中酵母菌YST2和除LAB2外其余的乳酸菌均存在不同程度的共生，共生原因還待進(jìn)一步研究。

乳酸菌，酵母菌，代謝產(chǎn)物，篩選，共生

微生物的共生現(xiàn)象最早由德國(guó)的真菌學(xué)家Heinrich Anton De Bary于1879年首次發(fā)現(xiàn)［1］。自然聯(lián)系的共生可能出現(xiàn)在幾個(gè)零星的菌落中，這些菌落基于特殊的信號(hào)分子（群體感應(yīng)）或是有粘著因子如蛋白質(zhì)或多糖（生物被膜）的共生體。這些聯(lián)系基于不同分子間相互作用，如理化環(huán)境的適應(yīng)（pH的改變）、營(yíng)養(yǎng)的相互作用（有機(jī)體得益于所共生的有機(jī)體的代謝因子）、不同有機(jī)體代謝物的交換導(dǎo)致其中一方不能獨(dú)自代謝（共生代謝）、蛋白的分泌、基因的轉(zhuǎn)移等［2］。

在已有研究中，SUDUN等從艾日格中篩選出典型的有共生關(guān)系的乳酸菌和酵母菌，通過探究復(fù)原脫脂乳代謝產(chǎn)物的變化反映出酵母菌促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)［3］。Pablo在關(guān)于發(fā)酵奶中的酵母菌和乳酸菌的相互作用實(shí)驗(yàn)中，將乳酸菌和酵母菌進(jìn)行純種培養(yǎng)和混合培養(yǎng)，表明大多數(shù)的共培養(yǎng)的組合中乳酸菌和酵母菌存在相互作用［4］。王洪志利用混合發(fā)酵和純種發(fā)酵探究了乳酸菌的加入對(duì)酵母菌生長(zhǎng)及對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的影響，表明乳酸菌的加入可以提高酵母菌的活菌數(shù)并且能夠改善產(chǎn)品風(fēng)味［5］。

但已有研究中，大都是以純種培養(yǎng)作對(duì)照，將乳酸菌和酵母菌混合培養(yǎng)觀察二者是否有共生關(guān)系。由于微生物之間的相互作用較難分析，尤其是不同菌群的微生物。基于此判斷微生物之間相互作用可添加一方的代謝產(chǎn)物測(cè)定另一方微生物的生長(zhǎng)情況。本實(shí)驗(yàn)采用交互添加代謝產(chǎn)物的方法通過測(cè)定濁度值和干重值對(duì)具有潛在共生作用的乳酸菌和酵母菌進(jìn)行篩選。實(shí)驗(yàn)篩選出具有典型共生作用的菌株為進(jìn)一步研究代謝產(chǎn)物的促生機(jī)制及菌株間的共生機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

實(shí)驗(yàn)所用菌株為8株酵母菌和9株乳酸菌由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)的內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌和酵母菌共生機(jī)理課題組提供，其中酵母菌編號(hào)為：YST1厚壁孢酵母屬、YST2厚壁孢酵母屬、YST3酒香酵母屬、YST4厚壁孢酵母屬、YST5酒香酵母屬、YST6婁德酵母屬、YST7畢赤氏酵母屬、YST8酒香酵母屬，乳酸菌編號(hào)為：LAB1乳酸鏈球菌、LAB2糞腸球菌、LAB3耐久腸球菌、LAB4糞腸球菌、LAB5乳酸片球菌、LAB6糞腸球菌、LAB7植物乳桿菌、LAB8舊金山乳桿菌、LAB9干酪乳桿菌；實(shí)驗(yàn)用MRS培養(yǎng)基及YEPD培養(yǎng)基按文獻(xiàn)［6］配制。

SW-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺(tái)蘇州蘇凈有限公司；HZQ-C氣浴恒溫振蕩器常州諾基儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱、電熱恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LRH系列生化培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司；PHS-25數(shù)顯酸度計(jì)中國(guó)雷磁分析儀器廠；HQ-60-Ⅱ漩渦混合器北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司；OHAUS EX623電子天平奧豪斯儀器（上海）有限公司；TOMY SX-500高壓滅菌鍋日本TOMY公司；T6新悅-可見光分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)湖南湘儀離心機(jī)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌種的活化與保藏乳酸菌于MRS液體培養(yǎng)基37℃靜置培養(yǎng)24h為活化一代，活化三代備用。酵母菌于YEPD液體培養(yǎng)基30℃振蕩培養(yǎng)30h為活化一代，活化三代備用。將活化好的乳酸菌和酵母菌置于實(shí)驗(yàn)室自制含有1%谷氨酸鈉的脫脂乳-80℃保藏。

1.2.2制備代謝產(chǎn)物按文獻(xiàn)［7］制備。方法如下：將活化好的乳酸菌于MRS培養(yǎng)基37℃靜置培養(yǎng)50h。將發(fā)酵液離心得到上清液，并過濾除菌。調(diào)節(jié)乳酸菌代謝產(chǎn)物的pH至5.5±0.2。將活化好的酵母菌于YEPD培養(yǎng)基30℃振蕩培養(yǎng)70h。將發(fā)酵液離心得到上清液，并過濾除菌。調(diào)節(jié)酵母菌的代謝產(chǎn)物pH至6.5±0.2。

1.2.3添加代謝產(chǎn)物的乳酸菌/酵母菌的培養(yǎng)將30%的酵母代謝產(chǎn)物添加到MRS液體培養(yǎng)基中作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)添加等量的pH為6.5±0.2的生理鹽水至MRS液體培養(yǎng)基作為對(duì)照組。MRS培養(yǎng)基接入2%的乳酸菌，37℃靜置培養(yǎng)20h，測(cè)其濁度值及干重值。將30%的乳酸代謝產(chǎn)物添加到Y(jié)EPD液體培養(yǎng)基中作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)添加等量的pH為5.5±0.2的生理鹽水至YEPD液體培養(yǎng)基作為對(duì)照組。YEPD培養(yǎng)基接入2%的酵母菌，30℃振蕩培養(yǎng)30h，測(cè)其濁度值及干重值。

1.3濁度值和干重值測(cè)定

1.3.1濁度值實(shí)驗(yàn)測(cè)定600nm的吸光光度OD值。通過實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的OD的差值可以得到：若OD差值為正，則實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組為促進(jìn)作用，若OD差值為負(fù)，則實(shí)驗(yàn)組低于對(duì)照組為抑制作用。

1.3.2干重值干燥的空離心管稱重標(biāo)記。整個(gè)過程發(fā)酵液以4000r/min速度離心20min。整個(gè)實(shí)驗(yàn)離心2次，生理鹽水沖洗1次。離心管中菌泥于電熱鼓風(fēng)干燥箱105℃烘干4h［8］。用m表示質(zhì)量則計(jì)算公式：m菌泥=m烘干后-m離心管，通過實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的干重的差值可以得到：若干重差值為正，則實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組為促進(jìn)作用，若干重差值為負(fù)，則實(shí)驗(yàn)組低于對(duì)照組為抑制作用。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)的每個(gè)處理做兩個(gè)平行樣，兩次重復(fù)。數(shù)據(jù)采用SPSS軟件11.0版本，在顯著水平為0.05和0.01下進(jìn)行單因素方差分析。

2　結(jié)果與分析

2.1乳酸菌代謝物對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響

表1是測(cè)定濁度值反映的乳酸菌代謝物對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響。由表1可知，有6株乳酸菌的代謝產(chǎn)物對(duì)YST1的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。LAB2的代謝產(chǎn)物對(duì)前4株菌有促進(jìn)作用。LAB3的代謝物對(duì)YST2、YST5的促進(jìn)作用極為顯著（p＜0.01）。LAB4的代謝產(chǎn)物促進(jìn)了前6株酵母菌的生長(zhǎng)。LAB5的代謝產(chǎn)物對(duì)YST1、YST2有促進(jìn)作用。LAB6代謝產(chǎn)物對(duì)所有的酵母菌都有抑制作用。LAB7的代謝產(chǎn)物對(duì)YST4的促進(jìn)作用顯著（p＜0.05），對(duì)YST2、YST7的促進(jìn)作用極顯著（p＜0.01）。LAB8對(duì)YST2的促進(jìn)作用顯著（p＜0.05）。LAB9僅對(duì)YST2有促進(jìn)作用。

表1　乳酸菌代謝產(chǎn)物對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響（△OD600nm）Table 1　Effect of lactic acid bacteria metabolites on the growth of yeast（△OD600nm）

表2是培養(yǎng)酵母菌的過程中添加乳酸菌代謝產(chǎn)物以生理鹽水作對(duì)照測(cè)得的干重值。除LAB1和LAB2外，其余的乳酸菌代謝產(chǎn)物菌對(duì)YST2均有促進(jìn)作用。LAB2的代謝物對(duì)YST4有促進(jìn)作用。LAB3的代謝物均促進(jìn)前5株酵母菌的生長(zhǎng)。LAB4代謝產(chǎn)物對(duì)YST2和YST6促進(jìn)作用極顯著（p＜0.01）。LAB5代謝產(chǎn)物對(duì)YST2、YST6、YST7促進(jìn)作用極顯著（p＜0.01）。LAB6代謝產(chǎn)物對(duì)一半的酵母菌有抑制作用。LAB7代謝產(chǎn)物對(duì)YST2、YST4、YST5、YST6有促進(jìn)作用。LAB8代謝產(chǎn)物對(duì)YST2、YST3、YST5、YST6有促進(jìn)作用。LAB9代謝產(chǎn)物對(duì)YST2有顯著的促進(jìn)作用（p＜0.05）。

表2　乳酸菌代謝物對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響（干重）Table 2　Effect of lactic acid bacteria metabolites on the growth yeast（△md）

綜合表1、表2的數(shù)據(jù)分析結(jié)果，在72組乳酸菌代謝物和酵母菌共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中有12組乳酸菌代謝產(chǎn)物促進(jìn)酵母菌的生長(zhǎng)。分別是：LAB2YST4、LAB3YST1、LAB3YST2、LAB4YST6、LAB3YST4、LAB3YST5、LAB4YST2、LAB5YST2、LAB7YST2、LAB7YST4、LAB8YST2、LAB9YST2，其中LAB4代謝物對(duì)YST2、YST6促進(jìn)作用極顯著（p＜0.01）。

2.2酵母菌代謝物對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響

表3顯示酵母菌的代謝產(chǎn)物對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)影響的濁度值。YST2、YST4的代謝產(chǎn)物對(duì)所有的乳酸菌均有促進(jìn)作用。YST3代謝產(chǎn)物對(duì)除LAB5、LAB7、LAB9，YST7的代謝產(chǎn)物對(duì)除LAB2和LAB6均有促進(jìn)作用。YST5對(duì)LAB1、LAB2、LAB9有促進(jìn)作用。YST6對(duì)LAB1、LAB2、LAB3、LAB9促進(jìn)作用極顯著（p＜0.01）。YST8代謝產(chǎn)物對(duì)LAB1和LAB8有促進(jìn)作用。

表4是酵母菌代謝產(chǎn)物對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響實(shí)驗(yàn)測(cè)得的干重值。橫向比較，所有的酵母菌的代謝產(chǎn)物均在不同程度上促進(jìn)了LAB1、LAB2、LAB4、LAB5、LAB7這5株乳酸菌的生長(zhǎng)。縱向比較，YST2、YST4、YST6、YST8的代謝產(chǎn)物對(duì)除LAB3外的乳酸菌，均有促進(jìn)作用。YST3的代謝產(chǎn)物對(duì)所有的乳酸菌均有促進(jìn)作用。YST5代謝產(chǎn)物促進(jìn)了除LAB6外其余乳酸菌的生長(zhǎng)。YST7代謝產(chǎn)物促進(jìn)了LAB1、LAB2、LAB4、LAB5、LAB6、LAB7的生長(zhǎng)。

綜合表3、表4，YST2、YST4的代謝產(chǎn)物促進(jìn)除LAB3的乳酸菌的生長(zhǎng)，YST3的代謝產(chǎn)物促進(jìn)除LAB5、LAB7、LAB9乳酸菌的生長(zhǎng)。YST5、YST6代謝產(chǎn)物均對(duì)LAB1、LAB2、LAB9有促進(jìn)作用。YST7代謝產(chǎn)物對(duì)LAB1、LAB4、LAB5、LAB7有促進(jìn)作用。YST8代謝產(chǎn)物對(duì)LAB1、LAB8有促進(jìn)作用。在72對(duì)組合中，有34組酵母菌的代謝產(chǎn)物促進(jìn)了乳酸菌的生長(zhǎng)，酵母菌代謝產(chǎn)物促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)的百分率達(dá)47.2%。

綜合表1～表4乳酸菌和酵母菌存在共生關(guān)系的組合有7個(gè)。其中LAB2、LAB7均和YST4共生。LAB4、LAB5、LAB7、LAB8、LAB9均和YST2共生。

3　討論

在已有的研究中對(duì)于乳酸菌和酵母菌共生的原因尚不明確。其中對(duì)于乳酸菌促進(jìn)酵母菌生長(zhǎng)的原因Marshall認(rèn)為一些乳酸菌釋放半乳糖，利于不能利用乳糖的酵母菌的生長(zhǎng)［9］。Cheirsilp等發(fā)現(xiàn)牛乳中混合培養(yǎng)乳酸菌和酵母菌，乳酸菌將乳糖分解成乳糖和半乳糖，而這些糖類利于酵母菌生長(zhǎng)［10］。Katakura等發(fā)現(xiàn)在酸性條件下，酵母菌的甘露糖蛋白與乳酸菌有關(guān)，這種蛋白能引起乳酸菌對(duì)酵母菌的黏附［11］。這為二者共生提供了有利的條件。而對(duì)于酵母菌促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)的解釋原因較為普遍的解釋是酵母菌能夠利用乳酸菌產(chǎn)生的乳酸，降低了環(huán)境中的pH，減少了大量積累的乳酸，利于乳酸菌的生長(zhǎng)。Cheirsilp等研究發(fā)現(xiàn)馬乳酒乳桿菌和釀酒酵母混合培養(yǎng)顯著提高了馬乳酒胞外多糖的產(chǎn)量。排除酵母菌引起乳酸量減少帶來的影響，酵母菌代謝產(chǎn)物不是促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)的原因，而是細(xì)胞內(nèi)容物促進(jìn)了乳酸菌的生長(zhǎng)［10，12］。Roostita等認(rèn)為乳酸菌所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)均可由酵母菌刺激產(chǎn)生。如酵母菌刺激乳酸菌合成維生素，或者酵母菌產(chǎn)生的氨基酸能被乳酸菌所利用［13］。這和SUDUN等的研究結(jié)果一致［3］。Jasmin等研究發(fā)現(xiàn)水開菲爾中的酵母菌和乳酸菌共培養(yǎng)中，酵母菌釋放了精氨酸和維生素B6促進(jìn)了乳酸菌的生長(zhǎng)［14］。Pablo則認(rèn)為乳酸菌和酵母菌共生的原因是共培養(yǎng)過程中產(chǎn)生了有機(jī)酸，這些酸能被乳酸菌/酵母菌利用［4］。本研究利用代謝產(chǎn)物篩選出具有共生作用組合，盡可能把影響微生物之間相互影響因素減少。在篩選出組合中發(fā)現(xiàn)YST2和大部分的乳酸菌共生，今后需要進(jìn)一步分析YST2代謝產(chǎn)物的成分及其對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響，找出二者共生的原因及影響機(jī)理。

表3　酵母菌代謝物對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響（△OD600nm）Table 3　Effect of yeast metabolites on the growth of lactic acid bacteria（△OD600nm）

表4　酵母菌代謝物對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響（干重）Table 4　Effect of yeast metabolites on the growth of lactic acid bacteria（△md）

4　結(jié)論

篩選具有共生關(guān)系的乳酸菌和酵母菌的實(shí)驗(yàn)中，有12組乳酸菌代謝產(chǎn)物促進(jìn)了酵母菌的生長(zhǎng)，而接近一半（47.2%）的酵菌代謝產(chǎn)物均促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)。篩選實(shí)驗(yàn)中，有7個(gè)共生組合，分別是：LAB2YST4、LAB4YST2、LAB5YST2、LAB7YST2、LAB7YST4、LAB8YST2、LAB9YST2。在這7個(gè)組合里，YST2和除LAB2外其余乳酸菌均存在共生作用。

［1］De Bary，H A.Die erscheinung der symbiose［M］.Austria：K. J Trubner，1879：8.

［2］Frey-Klett P，Burlinson P，Deveau A，et al.Bacterial-fungal interactions：hyphens between agricultural，clinical，environmental and food microbiologists［J］.Microbiology and Molecular Biology，2011，4：583-609.

［3］SUDUN，WULIJIDELIGEN，Kensuke A，et al.Interaction between lactic acid bacteria and yeasts in airag，an alcoholic fermented milk［J］.Animal Science Journal，2013，84：66-74.

［4］Pablo A’lvarez-Martl’n，Ana Bele’n Flo’rez，Ana Herna’ndez-Barranco，et al.Interaction between dairy yeasts and lactic acid bacteria strains during milk fermentations［J］.Food Control，2008，19：62-70.

［5］王洪志.奶啤生產(chǎn)中乳酸菌對(duì)酵母菌發(fā)酵作用的研究［J］.中國(guó)釀造，2009（6）：134-136.

［6］劉慧.現(xiàn)代食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2006：263-267.

［7］劉敏敏，賀銀鳳.酸馬奶中具有潛在共生性乳酸菌和酵母菌的篩選［J］.食品科學(xué)，2011，32（11）：255-259.

［8］Kimoto-nira H，Ohmori H，Suzuki C.Commensal symbiosis between a Lactococcus lactis strain and an Enterococcus mundtii strain increases cell yield in constituted broth［J］.Journal of Dairy Science，2012，95（11）：6372-6378.

［9］Marshall V M E，Tamine A Y.Microbiology and chemistry of cheese and fermented milk［M］.London：Blackie Academic and Professional，1997：153-192.

［10］CHEIRSILP B，SHIMIZU H，SHIOYA S.Enhanced kefiran production by mixed culture of Lactobacillus kefiranofaciens and Saccharomyces cerevisiae［J］.Journal of Biotechnology，2003，100（1）：43-53.

［11］Katakura Y，Sano R，Hashimoto T，et al.Lactic acid bacteria display on the cell surface cytosolic proteins that recognize yeast mannan［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2010，86：319-326.

［12］CHEIRSILP B，SHOJI H，SHIMIZU H，et al.Interactions betweenlactobacilluskeJiranofaciensandsaccharomyces cerevisiae in mixed culture for kefiran production［J］.JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING，2003，96（3）：279-284.

［13］Roostita R，F(xiàn)leet G H.The occurrence and growth of yeast in Camembert and blue-veined cheese［J］.International Journal of Food Microbiology，1996，28：293-404.

［14］Jasmin S，Anna G，Matthias A，et al.Metabolic activity and symbiotic interactions of lactic acid bacteria and yeasts isolated from water kefir［J］.Food Microbiology，2013，35：92-98.

Screening on the symbiotic lactic acid bacteria and yeasts

GUO Qian-ru，HE Yin-feng*
（College of Food Science and Engineering，Inner Mongolia Agriculture University，Huhhot 010018，China）

Nine strains of lactic acid bacteria and eight strains of the yeasts isolated from koumiss had been screened to select the symbiotic strains.Metabolites were added to the culture mediums with the addition of the same amount of saline as control groups.Turbidity values and dry weight values were measured in the stationary phase.There were twelve combinations that the metabolites of lactic acid bacteria promoted the yeasts growth.Nearly half of the yeasts metabolites promoted the growth of lactic acid bacteria.Seven combinations showed there were a symbiotic relationship between the yeasts and lactic acid bacteria.In a conclusion，the symbiotic combinations were LAB2YST4，LAB4YST2，LAB5YST2，LAB7YST2，LAB7YST4，LAB8YST2，LAB9YST2 respectively.Among them，YST2 and other lactic acid bacteria had showed different levels of the symbiotic relationship between each other except LAB2.The symbiotic reasons needed further study.

lactic acid bacterium；yeast；metabolite；screening；symbiosis

TS201.1

A

1002-0306（2015）02-0203-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.035

2014－05－26

郭倩茹（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

賀銀鳳（1960-），女，博士研究生，教授，研究方向：食品生物技術(shù)。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31060222）。