靈芝深層發酵產物抗氧化活性物質與抗氧化能力分析

謝麗源，甘炳成，彭衛紅，黃忠乾，譚　偉（四川省農業科學院土壤肥料研究所，四川成都610066）

靈芝深層發酵產物抗氧化活性物質與抗氧化能力分析

謝麗源，甘炳成，彭衛紅，黃忠乾，譚偉
（四川省農業科學院土壤肥料研究所，四川成都610066）

以不同靈芝菌株液體發酵產物作為研究材料，測定抗氧化活性物質含量，并利用多種抗氧化測定方法，分析不同菌株的體外抗氧化能力，評價活性物質含量間、抗氧化方法間及抗氧化方法與含量間的相關性。結果表明，供試菌株活性物質含量間的差異較大，紫芝13、德昌1號黃酮含量最高，而京大靈芝多糖、三萜、多酚含量顯著高于其余菌株（p＜0.05），且四種活性物質含量間相關性不大；不同靈芝菌株抗氧化活性不同，其中京大靈芝具有較高的還原力，白靈芝、金地靈芝、有柄樹舌2949 DPPH自由基清除能力較高，通江靈芝、紫芝101羥自由基清除能力較強，韓芝有較高的超陰離子自由基清除能力，且不同方法間存在較大差異，顯著性不明顯；四種活性物質含量與各抗氧化測定方法間相關系數低，表明靈芝的抗氧化能力貢獻并不完全來自這四類物質。

靈芝，深層發酵，抗氧化能力，抗氧化活性

自由基是人體進行生命活動時所產生的一種活性分子，正常情況下，自由基具有調節細胞間的信號傳遞和細胞生長、抑制病毒和細菌的作用。但體內自由基過多，可導致細胞和組織器官損傷、誘發各種疾病、加速機體衰老，最終導致疾病的發生［1］。抗氧化劑是有效的自由基終止劑，化學合成氧化劑由于對健康的潛在危害，在食品的應用越來越受到限制［2］。因此，研究開發天然抗氧化劑取代化學合成的抗氧化劑將成為必然趨勢，而大型真菌不僅具有高蛋白、低脂肪等豐富營養，還具有多種生理活性，是篩選無毒的具有抗氧化活性物質的最佳材料。因此，從食用菌中開發天然、高效、具有醫療保健功能的抗氧化食品或藥品具有較高的開發價值和廣闊的市場前景，已成為當今一個重要的研究方向。

目前體外抗氧化能力的測定方法比較多，這些方法與操作難易程度、生物相關性、反應機理、反應發生環境等相關。但是不論哪種方法都各有利弊，目前為止，沒有一種方法可以代替全部的方法而作為標準方法用于所有復雜抗氧化劑的評價，更沒有一種方法可以模擬生物體內的復雜環境。大多數的學者，在研究抗氧化能力時，使用一種或同時使用不同機理的兩種或三種方法來共同評價物質的抗氧化能力。然而，不同方法得出的結論并不一定都是一致的，有的甚至會得出相反的結論。由于方法的不統一使得目前有關抗氧化作用的研究十分混亂。因此，必須同時使用多種方法進行測定，評價不同方法間的相關性，建立多種方法的數據庫，為抗氧化活性研究提供參考標準，并為栽培、育種以及產品開發提供理論依據。

靈芝是我國著名的高等藥用真菌，具有抗腫瘤、免疫調節、鎮靜安神、強心及抗心肌缺血、調節血脂、平喘、保肝、降血糖、抗缺氧和清除自由基以及延緩衰老等較重要的藥理作用［3-7］。這些藥理活性與靈芝中含有的多糖類、三萜類、黃酮類、多酚類、有機鍺、無機離子、甾醇類等11大類活性物質密切相關［8］。而其中所含的多糖、三萜、多酚以及黃酮類物質是研究最為廣泛的抗氧化活性物質，但對其發揮抗氧化性能起著主要貢獻的功能成分缺乏定論。

本研究以23株不同靈芝菌株作為研究材料，測定多種活性物質，并利用多種抗氧化測定方法，對不同菌株的抗氧化能力進行系統評價和比較，揭示靈芝菌株在抗氧化方面的藥用價值，為其抗氧化機理研究以及進一步的開發利用提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

靈芝菌株均由四川省農業科學院微生物研究中心提供；DPPHSigma公司；標準齊墩果酸、葡萄糖、無水乙醇、香草醛、冰乙酸、高氯酸、乙酸乙酯、苯酚、過氧化氫、硫酸亞鐵、水楊酸、鄰苯三酚、鹽酸、磷酸鹽緩沖液、鐵氫化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、甲醇等均為分析純，上海生工生物工程技術服務有限公司。

UV1240紫外分光光度計日本島津儀器公司；GLI66-Ⅱ高速離心機上海安亭科學儀器廠；HH. S11-Ni6-列六孔恒溫水浴鍋北京長安科學儀器廠；ALC-Z10.3電子天平北京賽多利斯天平有限公司；R-201旋轉蒸發器上海申勝生物技術有限公司；SHB-Ⅲ循環水多用真空泵鄭州長城科工貿有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1液體發酵培養基葡萄糖30g/L，蛋白胨20g/L，KH2PO43g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，pH自然。

1.2.2發酵液制備接種10%液體種子培養基于裝液量為120mL發酵培養基（500mL三角瓶）中，培養溫度26℃，轉速120r/min，培養7d，過濾，收集發酵液，備用。

1.2.3多糖含量測定參考張惟杰方法［9］，繪制標準曲線，求出回歸方程（y=0.0147x+0.0081，R2=0.9968），得到多糖含量。

1.2.4總酚含量測定使用福林-肖卡法［10］，繪制標準曲線，求出回歸方程（y=0.1359x+0.0141，R2=0.9983），得到總酚含量。

1.2.5黃酮含量測定按照蘆丁-AlNO3法［11］繪制標準曲線，得回歸方程為（y=0.009x-0.0006，R2=0.9994），得到黃酮含量。

1.2.6三萜含量測定使用齊墩果酸作為標樣［12］，繪制標準曲線，求出回歸方程（y=0.057x+0.0804，R2= 0.9986），得到三萜含量。

1.2.7還原力測定［13］采用鐵氰化鉀還原法。

1.2.8對超氧陰離子自由基（O2-）清除作用研究采用鄰苯三酚自氧化法［13］。

1.2.9對羥自由基（·OH）的清除作用研究采用FeSO4-H2O2方法［13］。

1.2.10對DPPH·自由基清除作用研究采用DPPH-甲醇測定方法［13］。

2　結果與分析

2.1不同靈芝菌株活性物質含量分析

分別測定不同靈芝液體發酵產物的黃酮、多酚、多糖及三萜含量，結果見表1。由表1可見，靈芝發酵液中均含有豐富的黃酮、多酚、多糖及三萜類物質，但不同的靈芝菌株間，活性物質含量間存在較大差異，在所測定的23個靈芝菌株中，黃酮含量變異范圍為1.462～7.056μg/mL，多酚含量變異范圍為1.534～10.214μg/mL，多糖含量變異范圍為1.257～13.120μg/mL，三萜含量變異范圍為1.027～12.510μg/mL。黃酮含量比較高的靈芝菌株有紫芝13、德昌1號、美國靈芝、樹舌、紫芝19、紫芝20、無孢靈芝11，黃酮含量在5.313～7.056μg/mL，其中紫芝13、德昌1號含量最高；多酚含量較高的菌株有京大靈芝、無孢靈芝11、紫芝19、美國靈芝、樹舌、紫芝101，含量在6.847～10.214μg/mL，其中京大靈芝、無孢靈芝11、紫芝19含量高于其余菌株；多糖含量較高的菌株有京大靈芝、黑芝、無孢靈芝、南韓靈芝，含量在7.810～13.120μg/mL，其中京大靈芝含量顯著高于其余菌株；三萜含量較高的菌株有京大靈芝、紫芝101、黑芝、南韓靈芝、松杉靈芝、通江靈芝、美國靈芝，含量在9.065～12.510μg/mL，其中京大靈芝含量最高。

2.2不同靈芝菌株抗氧化自由基測定

分析不同靈芝菌株液體發酵產物的抗氧化能力，對23個靈芝菌株還原力、羥自由基、超氧陰離子自由基及DPPH自由基清除率進行比較，結果見圖1，研究發現不同靈芝菌株具有不同的抗氧化能力，即具有不同的自由基清除能力。在測定的23個菌株中，還原力變異范圍在0.220～0.884，DPPH自由基清除率變異范圍在21.101%～61.585%，羥自由基清除率變異范圍在11.247%～88.123%，超氧陰離子自由基清除率變異范圍在25.909%～69.024%。其中京大靈芝還原力最高（p＜0.01），OD值為0.884%，美國靈芝、有柄樹舌、金地靈芝均有較高的還原力，其OD值在0.637%～0.683%；白靈芝、金地靈芝、有柄樹舌2949有較高的DPPH自由基清除能力（p＜0.05或p＜0.01），清除率在60.404%～61.585%；通江靈芝、紫芝101羥自由基清除能力最高（p＜0.05或p＜0.01），清除率分別為88.123%、86.345%，而有柄樹舌2949、黑芝、韓國靈芝羥自由基清除能力僅次于以上菌株，清除率在83.240%～85.194%；韓芝有最高的超陰離子自由基清除能力（p＜0.05或p＜0.01），清除率為69.024%，而美國靈芝、有柄樹舌、金地靈芝、無孢靈芝、松杉靈芝、韓國靈芝、紫芝569、黑芝有較高的超氧陰離子自由基清除效果，清除率僅此于韓芝，清除率在58.597%～ 62.621%。

表1　不同靈芝菌株活性物質含量比較Table 1　Comparison of content on active substance among different strains

圖1　不同靈芝菌株抗氧化能力比較Fig.1　Comparison of antioxidant capacity on different strains

表2　不同抗氧化方法間的相關性Table 2　Lineal correlation coefficients among the different methods for quantifying antioxidant capacity

2.3不同測定方法間的相關性

從表2中可以看出，不同的體外評價抗氧化能力方法所得結果間，具有不同的統計學相關性，各測定方法間相關系數均較低，相關性不顯著（p＞0.05）。這是由于生物體有多種抗氧化系統，其中自由基的種類、產生機理、產生部位以及所作用的靶點的不同，相對應的抗氧化機理和能力就不同。不同的體外抗氧化能力測定是針對不同自由基的清除效果，但是，由于本研究測定樣品是發酵產物，成分復雜，對于其中含有的自由基種類不清楚，工作原理及相互間的關系不清楚，所以單一的測定方法很難對抗氧化物質進行綜合評價，因此不能用一種評價方法所得的結果，概況其他評價方法的結果，而應盡量選擇多種抗氧化評價方法，較全面、客觀的評價被評價化合物的抗氧化能力。

2.4樣品活性組分含量相關性研究

對活性物質含量間相關性進行分析，由表3可知，粗多糖含量與黃酮、三萜、多酚含量相關系數分別為-0.270、0.595、0.175（p＞0.05）；黃酮含量與三萜、多酚含量相關系數為-0.328、0.274（p＞0.05）；三萜含量與多酚含量相關系數為0.132（p＞0.05），由此說明針對同一菌株，這四種主要活性物質含量間存在較大差異，這是由于代謝產物累積途徑不同造成。

表3　活性物質含量間相關性Table 3　Correlation among active composition

2.5抗氧化能力與抗氧化物質含量的相關性

分析不同靈芝菌株的抗氧化能力與多酚類、黃酮類、粗多糖及三萜含量間的關系，根據前面對不同菌株的多酚、黃酮、粗多糖、三萜含量測定結果及不同方法測得的抗氧化能力結果作了相關性分析（表4）。由此可知，靈芝菌株多酚、黃酮、三萜及粗多糖含量與不同方法測得的抗氧化能力相關性不同，多酚含量與羥自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基及還原力方法測得的抗氧化能力間的相關系數分別為-0.122、-0.135、-0.012、0.267（p＞0.05）；黃酮含量與羥自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基及還原力方法測得的抗氧化能力間的相關系數分別為-0.411、-0.463、-0.147、-0.217（p＞0.05）；三萜含量與羥自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基及還原力方法測得的抗氧化能力間的相關系數分別為0.088、0.376、0.595、0.487（p＞0.05）；多糖與羥自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基及還原力方法測得的抗氧化能力間的相關系數分別0.161、0.170、0.371、0.592（p＞0.05）。由于羥自由基、DPPH、超氧陰離子自由基、還原力等抗氧化能力測定方法間相關系數較低，且各自間差異較大（如表2），說明各自由基產生機理、產生部位以及所作用的靶點的不同，而清除自由基的原理就不同。而對于主要活性物質多酚類、黃酮類、三萜類以及粗多糖與不同抗氧化測定方法間的相關性分析可見，其相關系數均較低，說明主要活性物質對于清除自由基效果不明顯，由此可見靈芝的抗氧化能力不是主要來自其中所含的粗多糖、三萜、黃酮和多酚類這四種物質，或者并不單獨來自這四類物質，其抗氧化能力可能與其他成分或者是活性物質共同作用產生。

表4　抗氧化能力與抗氧化物質含量的相關性Table 4　Lineal correlation coefficients between antioxidant composition and antioxidant capacity

3　結論與討論

由于生物體內存在多個抗氧化系統，他們的工作原理及相互間的關系尚不清楚，所以單一的測定方法很難對抗氧化物質進行綜合評價，另一方面測定的樣品大多為混合物，其成分十分復雜，而自由基的種類、產生機理、產生部位以及所作用的靶點的不同，相對應的抗氧化劑的抗氧化機理和能力就不同，因此需要對多個抗氧化測定方法綜合進行評價，以此來判斷該物質的抗氧化性能。本研究對23個靈芝菌株的抗氧化能力進行測定，通過不同測定方法間相關性分析表明，在所測定的23個靈芝菌株中，京大靈芝具有較高的還原力，白靈芝、金地靈芝、有柄樹舌2949 DPPH清除能力較強，通江靈芝、紫芝101有較高的羥自由基清除能力，韓芝有較高的超陰離子自由基清除能力，對不同方法間相關性分析研究發現，不同抗氧化方法間存在差異，各種方法測定的結果數值不一，且各測定方法間相關系數低，相關性不顯著。由此可見，不同的體外評價抗氧化能力方法所得結果間具有不同的統計學相關性，不能用一種評價方法所得的結果，概況其他評價方法的結果，而應盡量選擇多種抗氧化評價方法，較全面、客觀的評價被評價化合物的抗氧化能力。

對供試菌株的主要活性物質多糖、多酚、黃酮、三萜含量進行測定，研究表明，供試菌株含有較為豐富的多糖、三萜、總酚和黃酮類物質，其中紫芝13、德昌1號黃酮含量最高，而京大靈芝多糖、三萜、多酚含量顯著高于其余菌株。對活性物質含量間相關性進行分析發現，四種主要活性物質含量間相關性不大，而不同活性物質含量還應通過實際測量值為準，不能由一種活性物質含量來評價其他活性物質含量。

關于抗氧化能力強弱與活性物質含量的相關性，大多數研究都集中在食用菌多糖的抗氧化活性研究方面。盛偉等對白靈菇、杏鮑菇、阿魏菇多糖體外抗氧化活性研究發現，其多糖提取物均具有較強的體外抗氧化性能，且隨著多糖濃度的增大，其抗氧化活性逐漸增強［14］。張卉研究了姬松茸胞外純化多糖體外清除·OH和的能力，發現對清除能力強于·OH［15］。除此之外大量研究發現，靈芝多糖具有一定的清除自由基能力［16-17］。但是對抗氧化起著主要貢獻的物質還缺乏定論，而以往的研究結果不盡一致。Aziz Turkoglu等研究了硫磺菌提取物的抗氧化活性，認為總黃酮對抗氧化性起著重要作用［18］。Jeng-Leun Mau等對灰樹花、羊肚菌和雞樅菌三種食用菌的醇提物抗氧化活性研究發現，三種食用菌均具有較高的抗氧化能力，且認為抗氧化活性物質是酚類化合物［19］。Yu-Ling Lee等對真姬菇醇提物清除DPPH能力研究發現，起抗氧化作用主要是王宏雨等研究表明，食用菌抗氧化活性物質與提取物的分離相關，他的研究表明粗提物中含有較多的多糖、乙酸乙酯相含有較多的多酚類物質，而且各分離相的抗氧化活性也明顯不同［22］。而本研究結果表明，四種活性物質含量與各抗氧化測定方法間相關系數低、相關性不顯著，說明多酚類、黃酮類、三萜類以及粗多糖與抗氧化方法間相關性不大，由此表明靈芝的抗氧化能力貢獻并不完全來自這四類物質，或者并不單獨來自這四類物質。

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Analysis of antioxidant substances and antioxidant capacity of submerged fermentation product of Ganoderma Lucidum

XIE Li-yuan，GAN Bing-cheng，PENG Wei-hong，HUANG Zhong-qian，TAN Wei
（Institute of Soil and Fertilizer，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Chengdu 610066，China）

The objectives of this study were to analysis the differences of content of active antioxidant substances and the differences of antioxidant activity of liquid fermentation products from G.lucidum by a variety of antioxidant methods，and to further investigate the correlative relationships between contents of different active components，between results from different antioxidant assay methods and between contents of different active components and results from different antioxidant assay.The results showed that the contents of active substances on different strains had obvious difference，where the contents of flavonoid from ZZ13 and DC1 were the highest than those form others，and the contents of polysaccharide，triterpenes，polyphenol from JD were the highest（p＜0.05）.The correlation among active substances was low.The antioxidant activities of different strains were different，in which JD had a high reducing power，TJ and ZZ101 had the strongest effect on hydroxyl radical scavenging，BZ，Jindi and SS2949 had the strongest DPPH scavenging，and HZ had the highest superoxide radical scavenging effect.And there were significant differences among different methods，and significance was not obvious.The correlation coefficient between contents of four active substances and antioxidant was low，which indicated that the four active substances did not important contribute to antioxidant capacity from G.lucidum.

Ganoderma lucidum；submerged fermentation；antioxidant capacity；antioxidant activity

TS201.1

A

1002-0306（2015）02-0105-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.014

2014－04－11

謝麗源（1977-），女，博士研究生，副研究員，研究方向：農產品加工。

四川省應用基礎（2012JY0064）；優秀論文基金（2012LWJJ-002）。