雙波長比色法測定不同產地和品種青稞中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量

譚　亮，董　琦，耿丹丹，胡風祖（中國科學院西北高原生物研究所，青海西寧810001）

雙波長比色法測定不同產地和品種青稞中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量

譚亮，董琦，耿丹丹，胡風祖*
（中國科學院西北高原生物研究所，青海西寧810001）

利用一種更簡便、準確的雙波長比色法來測定不同產地和品種青稞中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量，以此代替以往復雜繁瑣的樣品前處理過程。根據雙波長比色原理——若溶液中某溶質在兩個波長下均有吸收，則兩個波長的吸收差值與該溶質濃度成正比，以及根據直鏈淀粉和支鏈淀粉與碘試劑作用分別產生純藍色和紫紅色的性質，用紫外分光光度計對兩種淀粉與碘試劑的反應液進行全波長掃描（450～900nm），用作圖法在同一個坐標系里確定其各自的測定波長和參比波長。結果測得直鏈淀粉的測定波長和參比波長分別為560nm和506nm，支鏈淀粉的測定波長和參比波長分別為545nm和722nm。青稞中直鏈淀粉和支鏈淀粉分別在0.20～0.59mg和0.50～3.00mg范圍內具有良好的線性關系（R2=0.9993和R2=0.9995），平均加樣回收率分別為91.14%和91.73%，RSD分別為1.70%和2.25%（n=9）。該方法簡便、準確、穩定性和重現性好，適用于測定青稞中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量，可為青稞的質量控制提供依據。

雙波長比色法，不同產地和品種，青稞，直鏈淀粉，支鏈淀粉，含量測定

青稞是生長在我國西北、西南特別是西藏、青海、甘肅等地的一種重要的高原谷類作物，亦稱裸大麥、米大麥、元麥，其學名是Hordeum vulgare L.var. nudum Hook.f.，屬禾本科小麥族大麥屬大麥變種之一［1］。青稞作為藏民傳統的主要農作物，已經由幾百年前的“農牧民專用”，到近年來隨著人們觀念的轉變，綠色食品的大力提倡，受到了都市人的寵愛。但傳統觀念中我國藏民主要將青稞制成糌粑，口感較粗糙，不易被人體吸收，如果能將青稞深加工成口感好易吸收的食品，其利用空間將會拓寬。淀粉是青稞的主要成分之一，占籽粒干重的65%左右，它包括直鏈淀粉和支鏈淀粉兩種。淀粉成分獨特，普遍含有74%～78%的支鏈淀粉，有些甚至接近100%［2］。支鏈淀粉的含量增加使淀粉品質整體優化，還可作為優良的增稠劑、乳化劑、黏著劑、懸浮劑而廣泛地應用于食品、造紙、紡織和黏著劑工業［3］；直鏈淀粉含量是影響糧食感官品質和加工特性的一個重要因素，其含量的高低，可作為評價糧食品質的一個重要指標［4］。所以，直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量測定對糧食的合理加工，淀粉的合理利用，農業選種、育種等均具有重要意義。

目前，關于青稞淀粉研究的內容有：青稞淀粉化學組成及工藝性質、淀粉顆粒特性、淀粉酶法提取工藝、抗性淀粉制備、青稞淀粉粒蛋白多態性及其與淀粉含量的關系以及基因型與環境效應對青稞淀粉含量的影響［5-10］等，而關于青稞中淀粉的含量以及組成淀粉的直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量測定未見文獻報道。測定淀粉含量的方法有間接測定法（包括酶解法、酶解-蒽酮比色法、試劑盒法、HPLC法等）和直接測定法（包括CaCl2-HOAC浸提法、雙波長比色法、近紅外光譜分析法等）［11-24］。這些方法大多存在使用試劑、儀器成本高，操作步驟繁瑣費時的問題，并且只能測定總淀粉含量。本文采用雙波長比色法快速、準確地測定出不同產地青稞中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量，進而由二者之和得出總淀粉的含量。該方法測定成本低、精度較高、結果較準確、重復性和穩定性好，同時可得到直鏈淀粉、支鏈淀粉和總淀粉3組數據，極大地提高了工作效率，適用于大批量樣品的測定，也為青稞淀粉的含量測定提供了確實可行的依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

青稞39批不同品種的青稞樣品采自西藏和青海不同產地（見表1），經中國科學院西北高原生物研究所分析測試中心胡風祖教授鑒定確認為正品（樣品預處理：將收集的樣品陰干，粉碎，裝入密封袋中密封，置干燥器中保存）；直鏈淀粉標準品上海惠誠生物科技有限公司（純度≥98%）；支鏈淀粉標準品上海惠誠生物科技有限公司（純度≥98%）；無水乙醇、氫氧化鈉、碘、碘化鉀、冰乙酸均為分析純。

表1　不同產地和品種的青稞樣品（n=3）Table 1　Hullessbarley samples collected from different habitats and varieties（n=3）

Cary300Bio型紫外-可見分光光度計美國Varian公司；PL203型電子天平、MS205DU型精密電子天平瑞士梅特勒-托利多公司；pHS-3E型pH計上海儀電科學儀器股份有限公司；XW-80A型渦旋混合器上海之信儀器有限公司；ML-1.5-4型數顯電加熱板北京中科奧博科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1碘試液的配制稱取碘化鉀2.0g，溶于少量蒸餾水中，再加碘0.2g，待溶解后用蒸餾水稀釋定容至100mL。

1.2.2直鏈淀粉和支鏈淀粉標準溶液的制備

1.2.2.1直鏈淀粉標準溶液的制備稱取直鏈淀粉標準品50mg，精密稱定，置于50mL容量瓶中，加入1mol/L氫氧化鈉溶液10mL，置沸水浴中溶解分散后，取出，冷卻至室溫，加入蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即濃度為1.0mg/mL的直鏈淀粉標準溶液（實際配制濃度為0.9896mg/mL）。

1.2.2.2支鏈淀粉標準溶液的制備稱取支鏈淀粉標準品50mg，精密稱定，按“1.2.2.1”項下操作方法制備成濃度為1.0mg/mL的支鏈淀粉標準溶液（實際配制濃度為0.9996mg/mL）。

1.2.3直鏈淀粉、支鏈淀粉測定波長和參比波長的確定

1.2.3.1直鏈淀粉吸收曲線繪制準確移取上述直鏈淀粉標準溶液0.5mL，置于25mL容量瓶中，加入蒸餾水15mL，以1mol/L冰乙酸溶液調節pH為3.5左右，加入碘試劑0.25mL，繼續加入蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。靜置15min后，以蒸餾水為對照，用雙光束分光光度計在450～900nm波段范圍內掃描，繪制直鏈淀粉吸收曲線。

1.2.3.2支鏈淀粉吸收曲線繪制準確移取上述支鏈淀粉標準溶液0.5mL，置于25mL容量瓶中，按“1.2.3.1”項下操作方法繪制支鏈淀粉吸收曲線。

1.2.3.3直鏈淀粉和支鏈淀粉測定波長和參比波長的確定將上述兩種淀粉標準溶液的吸收曲線疊加繪制在同一個坐標系里（450～900nm），依據溶液中某溶質在兩個波長下均有吸收，則兩個波長的吸收差值與該溶質濃度成正比的原理，通過等吸收點消除法確定測定波長和參比波長：

a.確定支鏈淀粉吸收曲線中相同吸光度A支1和A支2，其對應的波長分別為λ1和λ2，λ2處對應直鏈淀粉吸收曲線上較大的A值（A直2），故λ2作為直鏈淀粉的測定波長；λ1處對應直鏈淀粉吸收曲線上較小的A值（A直1），故λ1作為直鏈淀粉的參比波長；

b.確定支鏈淀粉吸收曲線中Amax所對應的λ4作為支鏈淀粉的測定波長；在λ4處找到相應直鏈淀粉吸收曲線上A直4，繼續在該曲線上找到與A直4相同的吸光度A直3，在支鏈淀粉吸收曲線上找到與A直3相同的λ3作為支鏈淀粉的參比波長。

1.2.4雙波長直鏈淀粉和支鏈淀粉標準曲線的繪制

1.2.4.1雙波長直鏈淀粉標準曲線準確移取上述直鏈淀粉標準溶液0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL分別置于6個25mL容量瓶中，加入蒸餾水15mL，以1mol/L冰乙酸溶液調節pH為3.5左右，加入碘試劑0.25mL，繼續加入蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。靜置15min后，以蒸餾水為對照，分別在λ1、λ2兩波長下測定Aλ1和Aλ2，以△A直=Aλ2-Aλ1為縱坐標，直鏈淀粉質量（mg）為橫坐標，繪制雙波長直鏈淀粉標準曲線。

1.2.4.2雙波長支鏈淀粉標準曲線準確移取上述支鏈淀粉標準溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0mL分別置于6個25mL容量瓶中，以下按“1.2.4.1”項下操作方法操作，以蒸餾水為對照，分別在λ3、λ4兩波長下測定Aλ3和Aλ4，以△A支=Aλ4-Aλ3為縱坐標，支鏈淀粉質量（mg）為橫坐標，繪制雙波長支鏈淀粉標準曲線。

1.2.5供試品溶液的制備和含量測定稱取0.1g已粉碎過60目篩的青稞樣品，置于25mL容量瓶中，精密稱定，加入0.5mL無水乙醇，渦旋以潤濕樣品。加入1mol/L氫氧化鈉溶液2mL，渦旋混勻，置沸水浴中加熱l0min，取出，冷卻至室溫，加入蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，過濾。準確移取兩份濾液各1.0mL置于25mL容量瓶中（一份作為樣品空白對照液，另一份作為樣品測定液），按“1.2.4.1”項下操作方法操作。其中，樣品測定液中加入0.25mL碘試劑，樣品空白對照液中不加碘試劑，均加入蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。靜置15min后，以各樣品空白液為對照，分別測定λ1、λ2、λ3、λ4處的吸光度值Aλ1、Aλ2、Aλ3和Aλ4，得△A直=Aλ2-Aλ1和△A支=Aλ4-Aλ3。分別在直鏈淀粉和支鏈淀粉標準曲線上求得相應△A值所對應的淀粉質量，即可計算出青稞樣品中直鏈淀粉和支鏈淀粉含量，二者之和即為總淀粉含量。

1.2.6方法學驗證實驗

1.2.6.1穩定性實驗取已制備好的樣品溶液（西藏甘孜藏青25），按“1.2.5”項下操作方法操作，室溫下放置，于λ1、λ2、λ3、λ4下每隔1h測定吸光度Aλ1、Aλ2、Aλ3和Aλ4，計算直鏈淀粉和支鏈淀粉的RSD值，檢測溶液的穩定性。

1.2.6.2重現性實驗準確吸取同一青稞樣品所提取的供試品溶液（西藏甘孜藏青25），按“1.2.5”項下操作方法操作，于λ1、λ2、λ3、λ4下測定吸光度Aλ1、Aλ2、Aλ3和Aλ4，計算直鏈淀粉和支鏈淀粉的RSD值，檢測方法的重現性。

1.2.6.3回收率實驗采用加樣回收法，在已知淀粉含量的青稞樣品供試液中按低、中、高濃度分別精密加入直鏈淀粉和支鏈淀粉標準溶液，每一濃度3份，并按“1.2.5”項下操作方法操作，于λ1、λ2、λ3、λ4下測定吸光度Aλ1、Aλ2、Aλ3和Aλ4，計算直鏈淀粉和支鏈淀粉的平均回收率和RSD值，檢測方法的回收率。

1.3數據處理

利用SPSS 16.0統計軟件，對西藏和青海青稞中總淀粉、直鏈淀粉和支鏈淀粉含量統計分析，進行獨立樣本t檢驗。

2　結果與分析

2.1直鏈淀粉和支鏈淀粉測定波長和參比波長的確定

當試液中含有兩種吸收光譜相互重疊的組分時，一般需進行萃取分離或加掩蔽劑的方法才能完成測定。如單波長法雖能對多組分物質進行定量分析，但其測定的準確度、靈敏度、選擇性和測定過程的簡單性均無法同雙波長法相比。采用的雙波長法僅用一個吸收池，且用試液本身作參比液，完全能消除吸收池和參比液等因素引起的誤差，提高了測定的準確度，又因測定的是試液在兩波長處的吸光度差值，故可提高測定的靈敏度和選擇性。所以采用雙波長法測定直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量是最合適的，也得到了很好的實驗結果。

將兩種淀粉標準溶液的吸收曲線疊加繪制在同一個坐標系里（450～900nm），可得如圖1所示的結果。由結果可確定直鏈淀粉的測定波長、參比波長分別為λ2=560nm和λ1=506nm；支鏈淀粉的測定波長、參比波長分別為λ4=545nm和λ3=722nm。

圖1　直鏈淀粉和支鏈淀粉吸收曲線掃描圖（450～900nm）Fig.1　Scanning spectrum of absorption curve of amylose and amylopectin（450～900nm）

2.2雙波長直鏈淀粉和支鏈淀粉標準曲線

2.2.1雙波長直鏈淀粉標準曲線以△A直=Aλ2-Aλ1為縱坐標，直鏈淀粉質量（mg）為橫坐標繪制標準曲線，繪制的標準曲線見圖2。由圖2可知，直鏈淀粉含量在0.20～0.59mg范圍內呈良好的線性關系，回歸方程為y=0.3019x-0.0132，R2=0.9993。

圖2　直鏈淀粉標準曲線Fig.2　Standard curve of amylase

2.2.2雙波長支鏈淀粉標準曲線以△A支=Aλ4-Aλ3為縱坐標，支鏈淀粉質量（mg）為橫坐標繪制標準曲線，繪制的標準曲線見圖3。由圖3可知，支鏈淀粉含量在0.50～3.00mg范圍內呈良好的線性關系，回歸方程為y=0.1418x+0.0098，R2=0.9995。

圖3　支鏈淀粉標準曲線Fig.3　Standard curve of amylopectin

2.3方法學驗證實驗結果

2.3.1穩定性實驗取已制備好的樣品溶液，按“1.2.5”項下操作方法操作，室溫下放置，于506、545、560、722nm下每隔1h測定吸光度A506nm、A545nm、A560nm和A722nm，結果表明供試品溶液在12h內穩定性良好，計算得直鏈淀粉和支鏈淀粉的RSD值分別為2.0%和2.3%。

2.3.2重現性實驗準確吸取同一青稞樣品所提取的供試品溶液，按“1.2.5”項下操作方法操作，于506、545、560、722nm下測定吸光度A506nm、A545nm、A560nm和A722nm，結果表明檢測方法的重現性良好，計算得直鏈淀粉和支鏈淀粉的RSD值分別為1.6%和1.8%。

2.3.3回收率實驗采用加樣回收法，在已知淀粉含量的青稞樣品供試液中按低、中、高濃度分別精密加入直鏈淀粉和支鏈淀粉標準溶液，每一濃度3份，并按“1.2.5”項下操作方法操作，于506、545、560、722nm下測定吸光度A506nm、A545nm、A560nm、A722nm，結果見表2、表3。計算得直鏈淀粉和支鏈淀粉的平均回收率分別為91.14%和91.73%，RSD分別為1.70%和2.25%，結果表明檢測方法具有良好的準確性。

表2　直鏈淀粉回收率實驗結果（n=9）Table 2　Results of recovery test of amylose（n=9）

表3　支鏈淀粉回收率實驗結果（n=9）Table 3　Results of recovery test of amylopectin（n=9）

2.4不同產地和品種青稞中兩種淀粉的含量測定

2.4.1最佳實驗條件考察通過對碘試劑與兩類淀粉顯色反應的條件考察，確定符合實驗的最佳樣品取用量、酸度條件（pH）、堿溶時間，極大地提高了分析檢測的速度和準確度。有文獻中報道稱樣量為200mg，而這樣的稱樣量至少需要好幾粒種子，本實驗分別考察了稱樣量為25、50、100、200、300mg的情況。結果隨著稱樣量的增加提取率也隨之增加，當超過100mg時提取率又隨之減少，其原因是稱樣量小時稱量的誤差大，稱樣量大時提取又不完全，超過了可將淀粉完全提取的飽和狀態，又考慮到樣品、試劑的用量和成本，選擇稱樣量為100mg作為最佳取用量；當維持其他條件不變時，根據pH對淀粉-碘絡合物的影響情況，溶液的酸度在pH2.0～5.0范圍內吸光值總體變化不大，呈現先上升后下降的趨勢，且當pH為3.5時有最大吸光值；在用氫氧化鈉溶液溶解青稞樣品中的淀粉時，分別考察了在沸水浴中的加熱時間5、10、15、20min，結果在10min時測得含量最高，分析原因是堿溶時間過長可能導致淀粉水解，使測量結果偏低，堿溶時間過短可能使淀粉不能完全溶解，所以確定最佳堿溶時間為10min。

2.4.2青稞中兩種淀粉含量測定結果采用雙波長比色法測定不同產地和品種青稞中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量結果見表4，二者之和即為總淀粉含量。由表4可知：所有青稞中支鏈淀粉含量均高于直鏈淀粉含量，其含量約高出2.6倍。在西藏青稞中，來自西藏海南的藏青690青稞總淀粉含量最高為67.55%，來自西藏日客則的柴青1號青稞總淀粉含量最低為55.00%；在青海青稞中，來自青海稱多的湟源藍青稞總淀粉含量最高為68.53%，來自青海玉樹的長芒白青稞總淀粉含量最低為58.14%。

表4　不同產地和品種青稞中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量測定結果（n=3）Table 4　Determination results of amylose and amylopectin in hullessbarley samples collected from different habitats and varieties（n=3）

2.5不同產地青稞中淀粉含量統計分析

通過SPSS 16.0軟件對西藏和青海青稞中總淀粉、直鏈淀粉和支鏈淀粉含量進行統計分析，結果見表5～表7。結果分析如下：由表5可知Levene方差齊性檢驗F=1.347，p=0.253＞0.05，說明兩樣本方差相等；進行方差齊性檢驗時，t=24.532，自由度df=37，雙尾檢驗概率p=0.000＜0.05，說明西藏和青海青稞中直鏈淀粉含量具有顯著性差異，西藏青稞中直鏈淀粉平均含量（21.52%）約高出青海青稞中直鏈淀粉平均含量（9.93%）2.2倍；由表6可知Levene方差齊性檢驗F=0.023，p=0.880＞0.05，說明兩樣本方差相等；進行方差齊性檢驗時，t=-15.084，自由度df=37，雙尾檢驗概率p=0.000＜0.05，說明西藏和青海青稞中支鏈淀粉含量具有顯著性差異，青海青稞中支鏈淀粉平均含量（53.01%）約高出西藏青稞中支鏈淀粉平均含量（39.22%）1.4倍；由表7可知Levene方差齊性檢驗F=1.894，p=0.177＞0.05，說明兩樣本方差相等；進行方差齊性檢驗時，t=-1.904，自由度df=37，雙尾檢驗概率p=0.065＞0.05，兩組數據間無統計學意義，說明西藏和青海青稞中總淀粉含量無顯著性差異，西藏青稞總淀粉平均含量（60.74%）略低于青海青稞總淀粉平均含量（62.75%）。

表5　不同產地青稞中直鏈淀粉含量的獨立樣本t檢驗Table 5　Independent samples test of amylose content in hullessbarley samples collected from different habitats

表6　不同產地青稞中支鏈淀粉含量的獨立樣本t檢驗Table 6　Independent samples test of amylopectin content in hullessbarley samples collected from different habitats

表7　不同產地青稞中總淀粉含量的獨立樣本t檢驗Table 7　Independent samples test of total starch content in hullessbarley samples collected from different habitats

3　結論

本研究中淀粉含量測定結果顯示：所有青稞中支鏈淀粉平均含量高于直鏈淀粉2.6倍；西藏青稞中藏青690總淀粉含量最高為67.55%，柴青1號總淀粉含量最低為55.00%；青海青稞中湟源藍青稞總淀粉含量最高為68.53%，長芒白青稞總淀粉含量最低為58.14%；西藏青稞中直鏈淀粉平均含量顯著高出青海青稞中直鏈淀粉平均含量，而青海青稞中支鏈淀粉平均含量顯著高出西藏青稞中支鏈淀粉平均含量，西藏和青海青稞中總淀粉含量相當，無顯著性差異。雙波長分光光度法作為一種淀粉含量的快速測定方法，具有樣品用量少、堿溶溫度低、環境污染小、省時省力、快捷、準確、重復性好、便于樣品的批量測定等特點。該方法可以同時得到直鏈淀粉、支鏈淀粉和總淀粉含量3組數據，既提高了實驗效率，又節省了樣品用量，適宜于大批量樣品分析，對于優異青稞品種材料的選育工作具有十分重要的意義。

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Determination of amylase and amylopectin in hullessbarley from different habitats and varieties by dual-wavelength colorimetric method

TAN Liang，DONG Qi，GENG Dan-dan，HU Feng-zu*
（Northwest Institute of Plateau Biology，Chinese Academy of Sciences，Xining 810001，China）

A more simple，accurate dual-wavelength colorimetric method was developed to determine the contents of amylose and amylopectin in hullessbarley from different habitats and varieties.It was replaced the previous complicated sample pre-treatment process.The reaction solution that reacted by two ingredient of starch and iodine reagents were scanned from 450nm to 900nm by UV spectrophotometer to determine its detection wavelength and reference wavelength in the same coordinate system which according to the principle of the dual-wavelength colorimetry——the difference was proportional to the concentration of solute while there were two absorption peaks at two different wavelengths from the same solute in the solution，as well as characteristic of blue appearance that amylase encountered with iodine reagents and purple red as amylopectin.The results indicated that the detection wavelength and reference wavelength were 560nm and 506nm for amylase，545nm and 722nm for amylopectin，respectively.The method had good linear relationship within the ranges of 0.20～0.59mg for amylose（R2=0.9993），0.50～3.00mg for amylopectin（R2=0.9995），respectively.The average recoveries（n=9）were 91.14%（RSD=1.70%）for amylose and 91.73%（RSD=2.25%）for amylopectin.The assay demonstrated that the method had adequate simple，accurate，good stability and reproducibility.It was suitable for the determination of amylose and amylopectin contents in hullessbarley.In addition，it could be used to assist the quality evaluation of hullessbarley.

dual-wavelengthcolorimetry；differenthabitatsandvarieties；hullessbarley；amylose；amylopectin；assay

TS237

A

1002-0306（2015）02-0079-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.008

2014－06－04

譚亮（1984-），男，碩士研究生，工程師，研究方向：天然產物研究與開發。

胡風祖（1955-），女，大學本科，研究員，研究方向：藏藥、民族保健食品、核心資源食品的研制開發。

中國科學院知識創新工程重要方向項目（KSCX2-EW-J-26）；農產品安全檢測公共技術服務平臺（2012-T-Y19）。