實時熒光聚合酶鏈式反應法檢測食品中狗源性成分

高曉麗，楊昕霆，薛晨玉，王　丹，趙琳娜，侯彩云，*（.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京00083；.北京市食品安全監控中心，北京0004）

實時熒光聚合酶鏈式反應法檢測食品中狗源性成分

高曉麗1，楊昕霆2，+，薛晨玉2，王丹2，趙琳娜2，侯彩云1，*
（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083；2.北京市食品安全監控中心，北京100041）

根據狗線粒體NADH氧化還原酶亞基2基因（ND2）中的序列設計了狗特異性引物和Taqman探針，建立了食品中狗源性成分的實時熒光聚合酶鏈式（Real-time PCR）檢測方法。實驗表明，該方法可以很好地區分狗與其他常見的14個物種，引物、Taqman探針特異性良好，檢測靈敏度可達100fg，適用于食品中狗源性成分的快速鑒定。

Real-time PCR，線粒體ND2基因，狗源性成分

近年來，食品中肉制品的安全問題日益突出，如國內的“假牛、羊肉事件”、“假鴨血事件”，國外的“馬肉風波”、“假鱈魚事件”。食品中的摻雜作假現象，不僅嚴重侵害消費者的權益，引發對食品安全的信任危機，一些疫情的發生與傳播也往往起因于不安全的動物食品［1-2］。我國針對飼料、明膠、化妝品中含有的豬、牛、羊、馬、驢、兔、狗等動物源性成分制定了相關標準［3］，但關于食品中動物源性成分的檢測標準并不完善。因此，建立準確、快速的食品中動物源性成分篩查方法至關重要。

國內外學者主要基于PCR方法對動物源性成分的鑒定進行了研究，大量報道了豬、牛、羊、雞、火雞、鴨、鵝、馬、驢等常見物種的普通PCR［4-10］和熒光PCR［11-18］研究，但針對狗源性成分鑒定的研究報道還不多。Tobe等［19］基于線粒體cytb基因建立了18個歐洲常見物種（狗、貓、牛、馬、驢、狐貍、山羊等）的多重PCR檢測方法，能夠鑒別混合肉中各物種340fg的模板DNA。Martin等［20］建立了食品和飼料中狗、貓、鼠源性成分鑒定的普通PCR方法，檢測限為0.1%。我國國標中只制定了動物源性飼料中狗源性成分的普通PCR定性檢測方法，檢出限為0.1%［21］。

在食品中動物源性成分的鑒定方面，與普通PCR和多重PCR法相比，實時熒光PCR法具有特異性強、靈敏度高、重現性好、有效降低污染、可實時監測等優點，是目前應用較普遍的方法之一［22］。本研究設計了狗線粒體ND2基因特異性引物和Taqman探針，建立了食品中狗源性成分的實時熒光PCR檢測方法。該方法可為保障食品安全、制定相應標準等提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

豬肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、鴿子肉、鵪鶉肉、兔肉等動物材料購自北京市農貿市場或超市；駱駝肉、馬肉、驢肉、狗肉、貓肉等動物材料為實驗室自存；20個牛羊肉串樣品購自北京市農貿市場；Tris-平衡酚、氯仿、無水乙醇、異丙醇、乙酸鈉均為國產分析純；CTAB提取緩沖液（20g/L CTAB，1.4mol/L NaCl，0.02mol/L Na2EDTA，0.1mol/L Tris-HCl，pH=8.0）、TE緩沖溶液（10mmol/L Tris-HCl，pH=8.0，1mmol/L EDTA）由本實驗室配制；Taqman實時熒光PCR預混合液（Premix Ex Taq）購自寶生物工程（大連）有限公司；狗ND2基因序列特異的上下游引物、Taqman探針由北京賽百盛基因技術有限公司合成。

核酸蛋白定量分析儀（分光光度計）德國Eppendorf公司；核酸自動提取儀QIA Cube美國QIA Gene公司；3K18冷凍離心機德國Sigma公司；MyiQ單色實時定量PCR儀美國伯樂公司；超低溫冰箱（-40℃）Biomedical freezer日本SANYO公司；Mili-Q純水器美國Milipore公司。

1.2動物組織基因組DNA的提取［23］

用滅菌手術剪分別剪取適量的豬肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、鴿子肉、鵪鶉肉、兔肉、駱駝肉、馬肉、驢肉、狗肉、貓肉的肌肉組織，剪碎置于研缽中（注意防止交叉污染）；加入石英砂，用液氮充分研磨至粉末狀，迅速取2g左右于2.0mL離心管中，立即加入1mL CTAB，混勻；置于核酸自動提取儀中加熱振蕩，消化30min；離心取600μL上清液于新的2.0mL離心管中，加入等體積的氯仿和Tris-平衡酚各300μL（1∶1，V/V），用力振蕩5min，使其充分反應，12000r/min室溫離心10min；取上清，加入600μL氯仿，同上，12000r/min室溫離心10min；取上清，加10%體積3mol/L乙酸鈉和2倍體積無水乙醇，輕緩顛倒數次，可見白色絮狀DNA，12000r/min室溫離心10min，棄上清液；加入1mL 70%乙醇洗滌沉淀2次，12000r/min室溫離心10min，棄乙醇；待DNA沉淀干燥后，將DNA溶于50～100μL無菌水中，用核酸蛋白定量分析儀測定DNA濃度，置于-20℃保存備用。

1.3引物與Taqman探針的設計

根據NCBI基因數據庫已注釋的、不同品系的狗（Canis lupus familiaris）線粒體序列（Accession Number：NC_002008，GI：17737322）和豬、牛、山羊、綿羊、雞、鴨、鵝、鴿子、鵪鶉、兔、駱駝、馬、驢、貓等物種的線粒體序列，分析生物進化樹的規律，使用DNAMAN軟件比對以上所有基因序列。選擇種內保守、種間差異較大的基因片段，根據引物和Taqman探針的設計原則，應用Primer Express軟件，設計引物和Taqman探針，將設計的引物和探針序列在NCBI的Blast中搜索、比對，最后選取既可以保證種內保守，又能保證種間特異的狗源性成分引物和Taqman探針。

1.4引物和Taqman探針特異性的驗證

以狗肉基因組DNA為陽性對照，豬、牛、山羊、綿羊、鴨、雞等14個物種基因組DNA為陰性對照，空白對照中以水代替DNA模板。所有DNA模板的質量濃度均稀釋至100ng/μL。實時熒光PCR反應體系為20μL，具體包括：Premix buffer（2×）10μL、上游引物（10μmol/L）0.5μL、下游引物（10μmol/L）0.5μL、Taqman探針（10μmol/L）1μL、DNA模板1μL、無菌水將體系補充至總體積20μL。實時熒光PCR擴增條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s；60℃延伸30s，記錄熒光值，40個循環。

在實時熒光PCR中，Ct值是指每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數。實時熒光PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺損設置是3～15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍，即threshold=10XSD cycle 6～15。因此，以Ct值小于35為陽性，Ct值大于35為陰性。特異性驗證實驗重復三遍。

1.5靈敏度和擴增效率檢測

在檢測該方法的靈敏度實驗中，將狗肉基因組DNA溶液分別稀釋為102、101、100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5ng/μL，每個濃度進行3次重復實驗，設置空白對照。根據各梯度的擴增曲線Ct值，建立Ct值-lg［DNA］的標準曲線。依據擴增效率計算公式Efficiency（%）=（-1+10［-1/slope］）×100，得到PCR反應擴增效率。以Ct值為判斷標準，確定檢出的最低濃度，作為該反應體系的檢測靈敏度。

1.6市售肉制品中狗源性成分的檢測

在北京農貿市場中隨機取樣20個牛、羊肉串，檢驗是否有摻雜摻假狗肉的情況。提取樣本基因組DNA，按照實時熒光反應體系，設置陽性對照、陰性對照和空白對照，進行實時熒光PCR反應。

2　結果與分析

2.1陽性物種樣本的鑒定

以CO1基因的DNA條形碼［24-25］擴增狗肉基因組DNA，并對擴增產物進行測序。將測序結果在NCBI中Blast搜索，結果如圖1所示。序列相似性為99%，從而確定狗物種樣本的真實性。

2.2引物和Taqman探針的特異性檢測結果

在特異性實驗中，用狗ND2基因特異性引物和Taqman探針體系分別擴增豬肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉、鴨肉、雞肉、鵝肉、鴿子肉、鴕鳥肉、鵪鶉肉、兔肉、馬肉、驢肉、貓肉的基因組DNA模板。結果表明，非目標物種基因組DNA的擴增曲線的Ct值均大于35，說明狗引物和Taqman探針特異性良好，如圖2所示。

2.3靈敏度、擴增效率檢測結果

以10倍為稀釋梯度，狗基因組DNA分別稀釋為102、101、100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5ng/μL。在10-5ng/μL濃度下，未檢測到目標物種。在102～10-4ng/μL濃度范圍內，建立Ct值-lg［DNA］的標準曲線，如圖3所示。標準曲線的R2為0.9957，線性相關度良好。PCR反應擴增效率為108%。DNA濃度為10-4ng/μL時，Ct值為34.6。該引物、Taqman探針的實時熒光反應體系可檢出10-4ng的模板DNA量。因此，靈敏度為100fg。

2.4市售樣本的檢測結果

在對市售的20個牛、羊肉串檢測實驗中，設置陽性對照、陰性對照和空白對照。檢測樣本、陰性對照、空白對照中并未檢出狗源性成分，陽性對照擴增曲線完好。說明，狗引物、Taqman探針具有很強的實際應用價值。

3　結論與討論

線粒體DNA是高等動物唯一的核外遺傳物質，是檢測中比較理想的靶基因，而且細胞中均含有大量的線粒體。目前，國內外學者關于線粒體的測序及其他研究已經非常透徹，在NCBI基因數據庫中有大量已發表并做注釋的線粒體序列，便于針對不同的物種進行引物和探針的設計。目前，國內外學者主要以線粒體中cytb、D-loop、12S rRNA、16S rRNA、ND1、ND2等基因作為目標基因位點，本研究通過篩查狗線粒體中的不同基因，并將設計的引物和探針序列在NCBI的Blast中搜索、比對，最終在狗線粒體ND2基因位點上，發現既可以保證種內保守，又可保證種間特異的引物和探針序列。因此，選取了狗線粒體ND2基因序列片段設計了引物和Taqman探針。

圖1　DNA條形碼擴增產物在NCBI中Blast搜索比對結果Fig.1　Sequence alignment of sequence amplification product

圖2　狗源性引物探針實時熒光PCR的特異性檢測結果圖Fig.2　Specific detection of real-time PCR for dog

圖3　Ct值-lg［DNA］的標準曲線Fig.3　Standard curve showing ct values in relation to the concentration of initial target gene copies

在實際樣本的檢測中，通過陽性對照、陰性對照和空白對照實驗，檢測樣本中并未檢出狗源性成分。需要注意點是，由于該方法的靈敏度較高，根據動物源性成分檢出量，不能判斷是意外污染還是蓄意添加。因此，需要結合其他方法進一步實驗，以便更好的判斷摻雜作假的程度。此外，該Taqman探針的熒光PCR反應體系是否適用于肉骨粉、明膠、化妝品中的狗源性成分的檢測，還有待于進一步驗證。

總之，狗ND2基因特異性引物、Taqman探針的熒光PCR反應體系特異性好，靈敏度高，穩定性強，實用性強，適用于食品中狗源性成分的檢測，可為食品安全檢測、打擊摻假摻雜等違法行為提供技術參考。

［1］卜登攀，王加啟，賀云霞，等.動物源性飼料檢測技術研究進展［J］.中國畜牧獸醫，2008，35（2）：54-59.

［2］陳文炳，邵碧英，廖憲彪，等.加工食品中若干動物成分的PCR檢測技術應用研究［J］.食品科學，2005，26（8）：338-342.

［3］李家鵬，喬曉玲，田寒友，等.食品和飼料中動物源性成分檢測技術研究進展［J］.食品科學，2011，32（9）：340-347.

［4］張慧霞，張利平，吳建平，等.鵪鶉源性成分PCR檢測方法的建立［J］.中國獸醫科學，2008，38（4）：346-349.

［5］陳穎，吳亞軍，徐寶梁，等.食品及飼料中馬屬動物源性成分的PCR檢測研究［J］.中國生物工程雜志，2004，24（5）：78-83.

［6］Colombo F，Viacava R，Giaretti M.Differentiation of the species ostrich（Struthio camelus）and emu（Dromaius novaehollandiae）by polymerase chain reaction using an ostrich-specific primer pair［J］.Meat Science，2000，56（1）：15-17.

［7］Wan Q H，Fang S G.Application of species-specific polymerase chain reaction in the forensic identification of tiger species［J］.Forensic Science International，2003，131（1）：75-78.

［8］Chen Y，Wu Y J，Xu B L，et al.Species-specific polymerase chain reaction amplification of camel（Camelus）DNA extracts［J］. Journal of Aoac International，2005，88（5）：1394-1398.

［9］Haunshi S，Basumatary R，Girish P S，et al.Identification of chicken，duck，pigeon and pig meat by species-specific markers of mitochondrial origin［J］.Meat Science，2009，83（3）：454-459.

［10］Rodriguez M A，Garcia T，González I，et al.PCR identification of beef，sheep，goat，and pork in raw and heat-treated meat mixtures［J］.Journal of Food Protection?，2004，67（1）：172-177.

［11］Ahmad A I，Ghasemi J B.New FRET primers for quantitativereal-time PCR［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2007，387（8）：2737-2743.

［12］Jonker K M，Tilburg J，H?gele G H，et al.Species identification in meat products using real-time PCR［J］.Food Additives and Contaminants，2008，25（5）：527-533.

［13］Laube I，Zagon J，Broll H.Quantitative determination of commercially relevant species in foods by real-time PCR［J］. International Journal of Food Science&Technology，2007，42（3）：336-341.

［14］K?ppel R，Zimmerli F，Breitenmoser A.Heptaplex real-time PCR for the identification and quantification of DNA from beef，pork，chicken，turkey，horse meat，sheep（mutton）and goat［J］. European Food Research and Technology，2009，230（1）：125-133.

［15］Hanna S E，Connor C J，Wang H H.Real-time Polymerase ChainReactionfortheFoodMicrobiologist：Technologies，Applications，and Limitations［J］.Journal of Food Science，2005，70（3）：R49-R53.

［16］Sawyer J，Wood C，Shanahan D，et al.Real-time PCR for quantitative meat species testing［J］.Food Control，2003，14（8）：579-583.

［17］Kesmen Z，Gulluce A，Sahin F，et al.Identification of meat species by TaqMan-based real-time PCR assay［J］.Meat Science，2009，82（4）：444-449.

［18］Chisholm J，Sánchez A，Brown J，et al.The development of species-specific real-time PCR assays for the detection of pheasant and quail in food［J］.Food Analytical Methods，2008，1（3）：190-194.

［19］Tobe S S，Linacre A M T.A multiplex assay to identify 18 European mammal species from mixtures using the mitochondrial cytochrome b gene［J］.Electrophoresis，2008，29（2）：340-347.

［20］Martín I，García T，Fajardo V，et al.Technical Note：Detection of cat，dog，and rat or mouse tissues in food and animal feed using species-specific polymerase chain reaction［J］.Journal of Animal Science，2007，85（10）：2734-2739.

［21］中國人民共和國山東出入境檢驗檢疫局，中國檢驗檢疫科學研究院，中華人民共和國遼寧出入境檢驗檢疫局，等.GB/T 21105-2007動物源性飼料中狗源性成分定性檢測方法PCR方法［S］.2007.

［22］Fajardo V，González I，Rojas M，et al.A review of current PCR-based methodologies for the authentication of meats from game animal species［J］.Trends in Food Science&Technology，2010，21（8）：408-421.

［23］Sambrook J，薩姆布魯克，Russell D W，et al.分子克隆實驗指南［M］.北京：科學出版社，2002.

［24］Hebert P D N，Cywinska A，Ball S L.Biological identifications through DNA barcodes［J］.Proceedings of the Royal Society of London.Series B：Biological Sciences，2003，270（1512）：313-321.

［25］Hebert P D N，Ratnasingham S，de Waard J R.Barcoding animal life：cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species［J］.Proceedings of the Royal Society of London.Series B：Biological Sciences，2003，270（S1）：96-99.

Detection for dog-derived components in foods by real-time polymerase chain reaction

GAO Xiao-li1，YANG Xin-ting2，+，XUE Chen-yu2，WANG Dan2，ZHAO Lin-na2，HOU Cai-yun1，*
（1.School of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China；2.Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring，Beijing 100041，China）

A rapid and highly species-specific real-time polymerase chain reaction（PCR）assay had been developed for the detection of dog-derived components in meat and meat mixtures.Primers and Taqman probe were designed on the mitochondrial ND2，and the performance of the method was tested.Results showed that no cross-reaction was observed between the dog and non-target species，and this method revealed a high sensitivity and could detect 100fg of dog template DNA.In conclusion，this real-time PCR assay could be a rapid and straightforward method for the accurate identification of dog-derived components in food.

Real-time PCR；mitochondrial ND2 gene；dog-origin ingredient

TS201.6

A

1002-0306（2015）02-0061-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.004

2014－04－09+為并列第一作者

高曉麗（1990-），女，碩士研究生，研究方向：農產品加工與貯藏。楊昕霆（1986-），男，碩士研究生，研究方向：動物源性成分檢測。

侯彩云（1963-），女，博士研究生，教授，研究方向：食品科學與加工技術。

北京市科技計劃課題（Z131100005613005）。