慢性乙型肝炎患者抗病毒治療過程中肝組織HBV cccDNA變化及與血清學指標的相關性

·論 著·

慢性乙型肝炎患者抗病毒治療過程中肝組織HBV cccDNA變化及與血清學指標的相關性

目的 觀察慢性乙型肝炎（乙肝）患者在阿德福韋酯（ADV）抗病毒治療過程中肝組織總的乙肝病毒核酸（HBV tDNA）、cccDNA含量變化及與血清 HBVDNA、HBsAg的相關性，探討肝組織HBV tDNA和cccDNA含量改變在抗病毒治療中的意義。方法 47例慢性乙肝患者口服ADV 10mg/d，每隔12周檢測病毒學、血清學和生化學等指標。47例基線患者和24例治療48周患者行肝組織活檢及肝組織HBV tDNA和cccDNA檢測。結果 47例慢性乙肝患者ADV治療48周后，HBVDNA低于檢查下限占36.2％（17/47）；ALT和AST復常率分別為76.6％（36/47）和85.1％（40/47）。比較基線和48周均取肝活檢的24例患者，48周時血清和肝組織中HBVDNA載量均較基線顯著下降（P＜0.01），血清HBVDNA下降值大于肝組織HBV tDNA和肝組織HBV cccDNA（分別為3.21lg拷貝/ml、1.02lg拷貝/細胞和0.76lg拷貝/細胞）。基線時，24例患者肝組織HBV tDNA、cccDNA與血清 HBVDNA和 HBsAg呈正相關（P＜0.01）；但治療48周時，各指標間無相關性。結論 ADV治療慢性乙肝患者可使其肝組織 HBV tDNA、cccDNA和血清 HBVDNA水平顯著下降，但血清HBVDNA下降較肝組織 HBV tDNA、cccDNA更為顯著。

慢性乙型肝炎；阿德福韋酯；乙型肝炎病毒共價閉合環狀DNA（HBV cccDNA）；熒光定量

資料和方法

一、研究對象

入組病例為2010至2012年解放軍第八八醫院就診的慢性乙肝患者47例，男性33例，女性14例，年齡20～65歲，平均年齡（35.7±12.4）歲。其中HBeAgg陽性37例，HBeAgg陰性10例，治療基線各項臨床指標特點見表1。納入和排除標準：入組病例均符合《慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）》建議的治療指征，所有患者在ADV規范治療前半年內未接受過抗病毒治療；排除合并失代償性肝硬化、自身免疫性肝病、藥物性肝病、代謝性肝病、酒精性肝炎及其他原因所致的肝損傷。所有患者給予ADV 10mg/d口服治療，隨訪觀察48周。每隔12周取血，檢測HBV 血清學標志物、HBVDNA和肝功能等指標。基線和治療48周時分別有47例和24例患者行肝穿刺活檢。

二、血清學相關指標檢測

采用科華試劑經酶聯免疫法進行HBV血清學標志物定性檢測；采用Abbott I2000（美國雅培公司）化學發光法定量檢測血清HBsAg；采用Abbottm2000全自動核酸檢測系統熒光定量PCR法檢測血清HBVDNA（根據雅培試劑說明書：1IU/mL=3.41拷貝/mL）；采用Abbott Aeroset全自動生化儀檢測血清ALT、AST等。

三、肝組織相關指標檢測

采用熒 光定量 PCR 法［8］檢測肝 組 織 中 HBV cccDNA和tDNA。肝組織炎癥活動度及纖維化程度分為0～4級（G）和0～4期 （S），病理學診斷結果由本院病理科出具報告。

四、耐藥位點檢測

據趙澄宇等［9］報道的巢式PCR方法擴增基線患者血清HBVRT區（若出現耐藥位點，擴增相應基線肝組織 HBV cccDNA RT區），送至北京英濰捷基生物科技有限公司進行雙向測序，采用ContigExpress、BioEdit5.0和DNAStar4.0以及http：//www.hivgrade.de/cms/grade/hbv-tool.html中的生物信息學工具分析測序結果。

五、統計學處理

采用SPSS16.0軟件進行統計分析。對非正態分布數據對數轉化后進行統計學分析。計量資料的比較采用t檢驗；計數資料的比較采用卡方檢驗；肝組織炎癥分級、纖維化程度的比較采用非參數檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 47例慢性乙肝患者的臨床特點

結果

一、ADV治療48周時HBVDNA和HBeAg陰轉率、ALT和AST復常率

47例慢性乙肝患者經ADV 治療48周時，HBVDNA＜103拷貝/mL者為36.2％（17/47），ALT復常率為76.6％（36/47），AST復常率為85.1％（40/47）。37例HBeAgg陽性患者HBeAgg陰轉率為13.5％（5/37），HBeAg/抗-HBe血清轉換率為0。

二、慢性乙肝患者肝組織和血清學指標在治療48周時變化情況

基線時，47例慢性乙肝患者肝組織HBV tDNA中位數是374.20拷貝/細胞，均值為（2.31±0.83）lg拷貝/細胞；HBV cccDNA中位數是3.31拷貝/細胞，均值為（0.41±0.65）lg拷貝/細胞。血清HBsAg均值為（4.12±0.76）lgIU/mL；HBVDNA均值為（7.93±1.65）lg拷貝/mL。HBeAgg陽性慢性乙肝患者肝組織HBV tDNA和cccDNA中位數均高于HBeAg陰性患者（462.49比35.42拷貝/細胞，P=0.005；3.31比0.53拷貝/細胞，P=0.011）。治療48周時，有24例患者行肝活檢檢查，其肝組織和血清學指標的變化情況見表2。24例患者血清和肝組織中病毒載量在48周時均較基線顯著下降（P＜0.01），血清HBVDNA下降值＞肝組織HBV tDNA＞肝組織HBV cccDNA（3.21lg拷貝/mL＞1.02lg拷貝/細胞＞0.76lg拷貝/細胞）。

三、基線時肝組織HBV tDNA和ccc DNA水平與血清HBVDNA、HBsAg的相關性

基線時，47例慢性乙肝患者肝組織HBV cccDNA與肝組織HBV tDNA呈顯著正相關（r=0.655，P＜0.001，見圖1A）。肝組織HBV cccDNA與血清HBVDNA及HBsAg呈正相關（r=0.466，P=0.001；r=0.540，P＜0.01，見圖1B、1C）。肝組織HBV tDNA與血清HBVDNA及HBsAg呈正相關（r=0.528，P＜0.01；r=0.495，P=0.003）。血清HBsAg與HBVDNA呈顯著正相關（r=0.681，P＜0.01）。在基線和48周時均取肝活檢的24例患者，肝組織HBV cccDNA與肝組織HBV tDNA及血清HBsAg呈正相關（r=0.497，P=0.013；r=0.422，P=0.040），與血清HBVDNA無相關性（r=0.225，P=0.291）。

表2 24例慢性乙肝患者基線和治療48周時肝組織和血清學指標變化

圖1A 治療基線時慢性乙肝患者肝組織HBV cccDNA與HBV tDNA的相關性分析（47例）

圖1B 治療基線慢性乙肝患者肝組織 HBV cccDNA與血清 HBVDNA的相關性分析（47例）

圖1C 治療基線時慢性乙肝患者肝組織 HBV cccDNA與血清HBsAg的相關性分析（47例）

四、ADV治療48周肝組織HBV tDNA和cccDNA與血清HBVDNA、HBsAg的相關性

ADV治療48周時，取肝活檢的24例患者肝組織HBV cccDNA與HBV tDNA呈正相關（r=0.620，P＜0.01，見圖2A）。肝組織HBV cccDNA 與血清HBVDNA及HBsAg均無相關性（r=0.351，P=0.092；r=0.168，P=0.433）。肝組織HBV tDNA與血清HBVDNA及HBsAg均無相關性（r=0.353，P=0.090；r=0.299，P=0.156）。血清HBVDNA與HBsAg呈顯著正相關（r=0.583，P＜0.01，47例）。

五、ADV治療48周時肝組織HBV tDNA和cccDNA下降值及與血清HBVDNA、HBsAg下降值的相關性

ADV治療48周時，24例慢性乙肝患者肝組織HBV cccDNA下降值與HBV tDNA下降值無相關性（r=0.387，P=0.062）。肝組織HBV cccDNA下降值與血清HBVDNA及HBsAg下降值均無相關性（r=0.273，P=0.197；r=0.182，P=0.395）。肝組織HBV tDNA下降值與血清HBVDNA及HBsAg下降值均無相關性（r=0.286，P=0.175；r=-0.037，P=0.865）。24例患者血清HBVDNA下降值與HBsAg下降值未見相關性（r=0.063，P=0.770），但47例血清HBVDNA下降值與HBsAg下降值呈正相關（r=0.440，P=0.002），分析結果不一致可能與例數不同有關。

六、ADV治療48周時肝組織學炎癥及纖維化分級的變化

24例慢性乙肝患者ADV治療48周時肝穿刺病理診斷，肝組織學炎癥和纖維化程度較治療前改善，炎癥改善率為45.83％（11/24）；纖維化改善率為29.17％（7/24）。經秩和檢驗（Mann-Whitney UTest），肝組織炎癥程度（G）較治療前顯著改善（Z=-2.865，P=0.004），肝組織纖維化程度（S）改善不顯著（Z=-0.255，P=0.799）。

七、基線耐藥檢測

47例慢性乙肝患者基線時檢測耐藥位點，2例患者血清HBVDNART區分別檢出LAM相關耐藥位點M204I和恩替卡韋（ETV）耐藥位點L180M+M204V+S202G，相應肝組織HBVcccDNA中也檢出相同耐藥位點（M204I和L180M+M204V+S202G）。其中，基線LAM耐藥患者ADV治療12周時血清HBeAgg轉陰，36周時HBVDNA降至檢測下限（3lg拷貝/mL），之后HBVDNA載量維持在較低水平（＜4lg拷貝/mL）；基線ETV耐藥患者ADV初始治療病毒學應答良好，治療12～48周時HBVDNA較基線下降＞4lg拷貝/mL，60周出現病毒學突破，經核實，患者這段時間服藥依從性欠佳，繼續治療，患者依從性良好，HBVDNA逐漸下降，治療84周時＜3lg拷貝/mL，之后維持在較低水平（＜4lg拷貝/mL）。

圖2A 治療48周時慢性乙肝患者肝組織HBV cccDNA和tDNA的相關性分析（24例）

圖2B 治療48周時慢性乙肝患者肝組織HBV cccDNA與血清 HBVDNA的相關性分析（24例）

圖2C 治療48周時慢性乙肝患者肝組織 HBV cccDNA與血清HBsAg的相關性分析（24例）

討論

抗病毒是治療慢性乙肝的關鍵。與干擾素相比，ADV用藥方便且不良反應相對較少；與LAM相比，ADV治療耐藥突變率較低；與ETV相比，ADV雖抗病毒力較低，但價格較便宜，因此，在我國基層醫院對慢性乙肝患者進行抗病毒治療時，ADV仍廣泛應用。

ADV抗病毒療效已得到大規模臨床試驗證實，可使患者獲得病毒學、肝功能和組織學的改善，且耐藥率較低。Marcellin等［10］研究顯示，口服10mg/dADV治療172例HBeAgg陽性慢性乙肝患者，48周后HBVDNA檢測不到率為21％，ALT復常率為48％，HBeAg陰轉率為24％，HBeAg血清學轉換率為12％。茅益民等［11］開展的一項多中心、隨機雙盲臨床試驗表明，ADV治療120例HBeAg陽性慢性乙肝患者有效且安全，治療48周時，HBVDNA陰轉率為34.2％，ALT復常率為75.3％，HBeAg陰轉率和血清學轉換率分別為6.42％和4.55％。本研究48周隨訪結果與以上文獻報道相似。47例慢性乙肝患者ADV治療48周后，HBVDNA陰轉率為36.2％（17/47），ALT復常率為76.6％（36/47），AST復常率為85.1％（40/47），37例HBeAg陽性患者血清HBeAg陰轉率為13.5％（5/37），但未觀察到 HBeAgg血清學轉換，可能與研究例數相對較少及治療期限短有關。

在本研究中，ADV治療48周后，血清HBVDNA已降到檢測限以下的患者，肝組織內仍能檢測到HBV cccDNA；治療48周肝組織HBV cccDNA僅下降0.76lg拷貝/細胞，遠低于血清 HBVDNA下降幅度（3.21lg拷貝/mL）。Werle-Lapostolle等［12］定量檢測22例 ADV治療的慢性乙肝患者肝組織HBV cccDNA，發現ADV治療48周后，HBV cccDNA平均下降0.8og拷貝/細胞，但發生 HBsAg清除及HBeAgg陰轉的患者肝組織仍檢測到HBV ccc DNA。可見抗病毒治療時，降低肝細胞內HBV ccc DNA水平是相當緩慢的過程，即使患者血清 HBeAgg轉陰，HBVDNA降到檢測限以下，肝組織內仍存在HBV cccDNA，停藥后很可能會造成病毒反彈，導致抗病毒治療失敗等一系列問題。一些研究探討將肝組織HBV ccc DNA水平動態監測作為判斷抗病毒治療療效及停藥的指標，Wursthorn等［13］檢測26例HBsAg陽性慢性乙肝患者肝組織HBV cccDNA 含量，經ADV聯合干擾素治療48周后，5例血清HBVDNA降至檢測限以下的患者，其肝組織仍檢測到HBV cccDNA；5例發生HBsAg血清學轉換的患者，仍有3例肝組織中檢出HBV cccDNA；8例患者發生HBeAgg陰轉，肝組織仍檢出HBV cccDNA。Sung等［14］隨訪觀察了47例拉米夫定單一或聯合聚乙二醇干擾素治療1年的HBeAgg陽性慢性乙肝患者，在治療結束時及結束后52周測定血清HBVDNA及肝組織HBV cccDNA，29例在治療結束時有病毒學應答，其中15例在治療結束后52周仍有持續應答反應，但患者肝組織中均存在HBV cccDNA，持續應答患者肝組織內HBV cccDNA水平顯著低于未取得持續應答患者。提示肝組織cccDNA定量檢測能更好地預測持續病毒學應答。同時提示，對于HBV cccDNA水平未顯著下降患者，延長治療以避免停藥復發，有利于取得抗病毒治療的持久療效。

在臨床實踐中，實施肝組織HBV cccDNA定量檢測，需要患者進行肝穿刺活檢，因此，HBV cccDNA定量檢測不易作為常規檢測項目。尋找與肝組織HBV cccDNA水平變化密切相關的血清學指標成為我們進一步探討的目的。在本研究中，慢性乙肝患者治療基線時肝組織HBV cccDNA 和tDNA 與血清HBVDNA、HBsAg顯著相關，但ADV治療48周后，肝組織HBV cccDNA和tDNA與血清HBVDNA及HBsAg均無相關性。Wursthorn 等［13］研究報道，26例慢性乙 患者基線時肝組織HBV ccc DNA與HBsAg顯著相關（P=0.006），ADV聯合干擾素治療48周后，肝組織 HBV cccDNA與HBsAg無相關性（P=0.600），與我們的研究結果一致。本研究還統計分析了24例患者從治療基線到48周時肝組織HBV cccDNA、tDNA和血清HBVDNA、HBsAg水平下降情況，相關性分析顯示，肝組織HBV cccDNA下降值與血清HBVDNA及HBsAg下降值均無相關性（r=-0.258，P=0.223；r=0.199，P=0.352）。HBV cccDNA下降程度與HBsAg下降程度無相關性，與Wong等［15］報道的ADV治療1年觀察結果一致。Chan等［16］研究26例 HBeAgg陽性慢性乙肝患者抗病毒治療基線和2年時肝內cccDNA和 HBsAg關系，治療前肝內HBV cccDNA與血清HBsAg有明顯相關性（r=0.54，P=0.004），治療后肝內HBV cccDNA下降水平與 HBsAg下降水平明顯相關（r=0.68，P＜0.001），但在治療2年時，HBV cccDNA和HBsAg水平的相關性差異無統計學意義（P＞0.05）；本研究結果與該報道差異之處可能與治療療程不同有關。以往研究例數均較少，有關HBV cccDNA與血清HBsAg相關性的研究需要擴大樣本量，尤其是增加抗病毒治療前后均取肝活檢的病例數，因此，血清HBsAg定量檢測是否可作為反映肝內cccDNA水平的指標，有待進一步研究證實。

綜上所述，ADV抗病毒治療可有效抑制HBV復制，改善肝功能及肝臟炎癥活動程度，并逆轉肝纖維化的形成，降低生化學、血清學和病毒學指標以及肝組織HBV tDNA、HBV cccDNA水平。在ADV抗病毒治療中，生化學、血清學和病毒學指標結合肝組織炎癥和纖維化程度變化以及肝組織HBVDNA、HBV cccDNA水平變化，能更加完善地評價抗病毒療效，為選擇合適的停藥時機提供綜合依據，從而使更多患者取得持續病毒學應答，減少治療后復發。在抗病毒治療中，有關肝組織HBV tDNA 和cccDNA水平變化與血清HBVDNA和HBsAg等指標的相關性以及血清學指標替代肝組織指標的可能性，需要擴大觀察患者例數并延長治療隨訪時間繼續研究和探討。

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12 Werle-Lapostolle B，Bowden S，Locarnini S，et al.Persistence of cccDNA during the natural history of chronic hepatitis B and decline during adefovir dipivoxil therapy.Gastroenterology，2004，126：1750-1758.

13 Wursthorn K，Lutgehetmann M，Dandri M，et al.Peginterferon alpha-2b plus adefovir induce strong cccDNA decline and HBsAg reduction in patients with chronic hepatitis B.Hepatology，2006，44：675-684.

14 Sung JJ，Wong ML，Bowden S，et al.Intrahepatic hepatitis B virus covalently closed circular DNA can be a predictor of sustained response to therapy.Gastroenterology，2005，128：1890-1897.

15 Wong DK，Seto WK，Fung J，et al.Reduction of hepatitis B surface antigen and covalently closed circular DNA by nucleos（t）ide analogues of different potency.Clin Gastroenterol Hepatol，2013，11：1004-1010.

16 Chan HL，Wong VW，Tse AM，et al.Serum hepatitis B surface antigen quantitation can reflect hepatitis B virus in the liver and predict treatment response.Clin Gastroenterol Hepatol，2007，5：1462-1468.

（本文編輯：錢燕）

PCR Relationship between the serum HBVDNA and the change of the intrahepatic HBV cccDNA levels in antiviral therapy for chronic hepatitis B

LIU Xue-yan，SHANG Qing-hua，LIU Xue-en，ZHUANG Hui.Fujian Cosunter Pharmaceutical Co.，Ltd.，Fuzhou 350003，China

Objective To investigate the correlations between the The serum HBVDNA and the intrahepatic HBV tDNA and cccDNA levels were decreased significantly after 48 weeks intrahepatic HBV tDNA，cccDNA and serum HBVDNA，HBsAg levels in patients with chronic hepatitis B treated with adefovir dipivoxil（ADV）.The association between the antiviral response and the changed levels of the intrahepatic HBV tDNA and cccDNA was explored.Methods Forty seven patients with chronic hepatitis B were treated with ADV 10 mg/d.The virological，serological and biochemical parameters were measured every 12 weeks during treatment.Liver biopsies were performed in 47 patients at baseline and 24 patients at 48 weeks.The intrahepatic HBV tDNA and cccDNA levels were quantitated by real-time PCR.Results The sero-negative rate of HBVDNA was 36.2％ （17/47），and normalization rates of ALT and AST levels were 76.6％（36/47）and 85.1％ （40/47）in 47 patients treated with ADV for 48 weeks.The serum HBVDNA and the intrahepatic HBV tDNA and cccDNA levels were decreased significantly after 48 weeks therapy in 24 patients performed liver biopsies at baseline and 48 weeks.The decreased values of serum HBVDNA，the intrahepatic HBV tDNA and cccDNA were 3.21 log copies/mL，1.02 log copies/cell and 0.76 log copies/cell，respectively（P＜0.01）.At baseline，the intrahepatic HBV tDNA and cccDNA levels were positively correlated with serum HBVDNA and HBsAg.However，the correlations were not observed after 48 weeks treatment.Conclusion The intrahepatic HBV tDNA、cccDNA and serum HBVDNA levels were decreased significantly after 48 weeks ADV therapy.The correlations between the intrahepatic HBV tDNA，cccDNA and serum HBVDNA，HBsAg levels were observed at baseline but not at 48weeks，suggesting serum HBVDNA and HBsAg could not be the alternative for HBV tDNA and cccDNA.

Chronic hepatitis B；Adefovir dipivoxil；Hepatitis B virus covalently closed circular DNA；Real-time PCR

國家“十二五”傳染病重大專項（2013ZX10002004，2012ZX10002003）

350003福州福建廣生堂藥業股份有限公司（劉雪艷）；山東解放軍第八八醫院肝病中心（商慶華）；北京大學醫學部基礎醫學院病原生物學系和感染病中心（劉學恩，莊輝）

HBV感染是嚴重的全球性健康問題之一，目前全球約20億人感染過HBV，其中約3.5億為HBV慢性感染，每年約100萬人死于乙型肝炎（乙肝）相關終末期肝病、肝硬化或肝癌［1］。我國是HBV感染高發區，2006年全國乙肝血清流行病學調查表明，HBsAg陽性攜帶者約7.18％［2］，其中25％發展為慢性乙肝。符合治療指征的慢性乙肝患者將接受核苷（酸）類似物和干擾素等抗病毒藥物治療，這些藥物能夠有效抑制病毒復制，降低外周血乙肝病毒載量［3］，減少慢性乙肝患者終末期肝病、肝硬化和肝癌的發生。阿德福韋酯（ADV）是我國目前臨床上常用的四種核苷類抗病毒藥物之一，國內外大量研究顯示ADV可顯著改善慢性乙肝患者的生化學、病毒學、血清學、組織學指標，且長期用藥耐藥率較低［4］。同時，ADV對病毒野生株及拉米夫定（LAM）耐藥株、前C區變異株等各種HBV毒株感染均有效［5］。

HBV復制過程中形成的共價閉合環狀DNA（HBV cccDNA）是慢性乙肝患者抗病毒治療時產生耐藥和停藥后反跳的重要原因［6］。Bourne等［7］報道肝組織中HBV cccDNA水平與抗病毒治療的療效和持續應答有關，提出肝組織中HBV ccc DNA定量檢測對臨床抗病毒療效的監測和治療方案的調整等具有重要意義。本研究采用實時熒光定量PCR（RTPCR）對ADV治療前、后慢性乙肝患者肝組織HBV cccDNA進行定量檢測，研究其與血清HBVDNA、HBsAg等在治療隨訪中的變化和相互關系，旨在探討肝組織HBV cccDNA含量的改變在抗病毒治療中的指導意義以及血清學指標代替肝組織指標的可能性。

2015-06-15）

劉雪艷 商慶華 劉學恩 莊輝