PEG10表達與原發(fā)性肝癌預后相關性分析

張海 胡亞華 朱艷莉 常城 李丹 余力群

·論 著·

PEG10表達與原發(fā)性肝癌預后相關性分析

張海 胡亞華 朱艷莉 常城 李丹 余力群

目的 檢測PEG10在原發(fā)性肝癌（PHC）組織中表達的情況，探討其與臨床病理參數的關系及對肝癌預后的臨床意義。方法 應用免疫組織化學方法（SP法）檢測58例PHC患者肝組織中PEG10的表達情況，并分析PEG10與PHC臨床病理特征及預后的關系。結果 58份PHC標本中44份PEG10陽性，其中“+”16份、“++”13份和“+++”15份。平均隨訪時間為40.5m，至隨訪結束時共有23例（39.7％）患者死亡；所有患者中位生存時間為31m，PEG10表達為“-”、“+”、“++”、“+++”的中位生存時間分別為57、34、27和15m，不同PEG10表達組間生存率差異有統計學意義（P=0.000）；PEG10在女性、晚期病例、術前AFP＞200ng/mL、微血管侵犯、低分化肝癌患者腫瘤組織中表達更高（P＜0.05），而與患者年齡、腫瘤直徑、病因無關（P＞0.05）；早期復發(fā)病例中PEG10陽性比例明顯高于陰性（P＜0.05），而晚期復發(fā)病例組間無明顯差異（P＞0.05）。PEG10預測PHC復發(fā)的診斷特異度77.5％，敏感度為38.9％，準確率為65.5％，多因素COX模型中AJCC分期、微血管侵犯、病因和PEG10表達是影響PHC預后的危險因素（P＜0.05），其中PEG10陽性的HR達6.724。結論 PEG10對PHC預后具有很好的評估價值，但是其特異性高而敏感性不高，需要聯合其他指標作出綜合評價。

PEG10；原發(fā)性肝癌；復發(fā)

原發(fā)性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）是一種高侵襲性惡性腫瘤，由于晚期診斷、腫瘤復發(fā)和化療藥物耐受等多種風險因素的共同作用，PHC總體預后相對較差，辨別預后不良的患者并進行及時的干預是提高PHC生存率最有效的方法之一［1］。印跡基因父系表達基因10（paternally expressed gene 10，PEG10）于2001年首次由 Ono發(fā)現后受到學界高度關注，研究表明，PEG10基因的高表達與腫瘤特別是肝癌發(fā)生關系密切［2］。本研究采用免疫組化技術檢測PHC組織中PEG10的表達，并分析其與預后的相關性，為臨床決策提供更多依據。

資料和方法

一、研究對象

選擇2009年2月至2012年11月期間在黃石市中心醫(yī)院肝膽外科擇期行肝癌根治性切除術的患者，入選標準：①年齡≤70周歲，性別不限；②腫瘤組織完整切除（指術后1m影像學檢查無病灶殘留，同時手術切緣病理學陰性），術后病理組織學確診為PHC，術前術后均未進行放、化療及免疫治療；③了解研究內容、愿意配合隨訪并簽署知情同意書。收集患者性別、年齡、腫瘤直徑、美國癌癥聯合委員會（AJCC）分期、分化程度、微血管侵犯、AFP和病因等資料。患者術后每3個月復診1次，根據需要進行體格檢查、影像學或活體組織檢查，生存期從手術之日起開始計算，終止日期為死亡期或末次隨訪日期，截止時間為2014年12月31日。

二、主要試劑

鼠源性PEG10單克隆抗體，由上海基因科技有限公司生產，按1∶400的體積濃度進行稀釋；SP免疫組織化學染色試劑盒、濃縮型DAB試劑盒均購自北京綠源大德生物科技有限公司。

三、標本制備

采用SP法進行免疫組織化學染色，石蠟包埋手術標本制成4μm厚切片，抗原修復采用高壓熱修復法，在沸水中加入0.01mol/L的檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0），將玻片置于金屬染色架上緩慢加壓30min，蓋上不銹鋼鍋蓋但不鎖定，10min后除去熱源，置入涼水中。鼠源性PEG10單克隆抗體室溫下孵化30min，免疫組化染色SP法檢測各標本組織中PEG10的表達，操作步驟嚴格參照試劑盒說明書。以胎盤蛻膜組織切片作陽性對照，以磷酸鹽緩沖液代替抗體做陰性對照。

四、檢測方法

PEG10陽性表達由兩位高年資的病理科醫(yī)師分別進行判斷，PEG10抗原陽性反應表現為細胞質內的棕黃色顆粒，按染色強度及陽性細胞數占腫瘤細胞總數的百分比綜合計分。每張切片隨機采集10個具有代表性的視野以半定量的方法計算陽性表達率，根據胞質或胞膜有棕黃色顆粒染色強度分為無色（-）為0分，淡黃色（+）為1分，棕黃色（++）為2分，棕褐色（+++）為3分；陽性細胞數：小于總數的5％（-）計為0分，5％～25％（+）為1分，26％～50％（++）為2分，大于50％（+++）為3分。染色強度得分與陽性細胞數得分相乘，0分計為陰性（-），1～3分計為弱陽性（+），4～5分計為中度陽性（++），≥6分計為強陽性（+++）［3］。

五、統計學方法

以SPSS19.0統計學軟件進行數據分析，其中PEG10蛋白表達與PHC臨床病理學特征采用χ2檢驗，組間生存情況分析采用Kaplan-Meier分析，不同生存曲線的差異性檢驗用對數秩檢驗（Log-rank test）；運用多因素COX模型綜合評價和權衡各因素對預后生存的影響，均以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

一、一般情況

共收集手術標本58份，PEG10陽性44份（75.9％），其中“+”16份、“++”13份和“+++”15份；隨訪時間為5～68m，中位隨訪時間為40.5m，至隨訪結束時共有23例（39.7％）患者死亡。

二、PHC組織中PEG10表達與生存時間的關系

所有患者中位生存時間為31m，PEG10“-”、“+”、“++”、“+++”患者中位生存時間分別為57、34、27和15m，不同PEG10表達組間生存率差異有統計學意義（χ2=40.114，P=0.000），PHC患者生存時間隨PEG10表達強度增加而逐漸下降，見表1和圖1。

表1 不同PEG10表達與生存時間的關系

三、PEG10與PHC患者臨床病理參數的關系

PEG10在女性、晚期病例、術前AFP＞200ng/mL、微血管侵犯、低分化肝癌患者腫瘤組織中表達更高（P＜0.05），而與患者年齡、腫瘤直徑、病因相關性較小（P＞0.05）；早期復發(fā)病例（≤2y）中PEG10陽性比例明顯高于陰性（P＜0.05），而晚期復發(fā)病例組間無明顯差異（P＞0.05），見表2。

圖1 不同PEG10表達與PHC總生存率的關系

表2 PEG10表達與PHC患者臨床病理參數的關系

四、PEG陽性對PHC復發(fā)的預測價值

以 PEG10陽性（包括+、++和+++）預測PHC復發(fā)，診斷特異度77.5％，敏感度為38.9％，陽性預測值43.75％，陰性預測值為73.8％，準確率為65.5％（Kappa值為0.217，P=0.824）。

五、COX比例風險模型分析

對可能影響原發(fā)性肝癌預后的9個相關因素：患者年齡、性別、腫瘤直徑、AJCC分期、分化程度、微血管侵犯、AFP、病因和PEG10的表達引入多因素COX模型，結果顯示，AJCC 分期、微血管侵犯、病因和PEG10的表達是影響PHC預后的因素（P＜0.05），其中PEG10表達HR達6.724，見表3。

表3 PHC臨床病理特征與生存時間的多因素COX 回歸分析

討論

隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，越來越多的血清腫瘤標志物被發(fā)現，對惡性腫瘤的早期診斷、疾病發(fā)展以及預后監(jiān)測提供了幫助。PEG10基因定位于人類染色體7q21，主要編碼一種與反轉錄病毒gagpol蛋白具有高度同源性的蛋白質［4］。PEG10基因具有更高的肝癌組織特異性，在相應的癌旁組織、正常肝組織中以及其他非肝臟來源的腫瘤細胞中均不表達。基礎研究表明，PEG10基因可能存在特異性調控肝臟細胞生長的作用，上調PEG10的表達能促進癌前組織向癌組織發(fā)展，而沉默PEG10表達可以抑制肝癌細胞的生長［5］。因此，通過抑制PEG10的表達，有可能成為抑制PHC發(fā)生和發(fā)展的治療手段，使PEG10具有作為肝癌診斷標志物和基因治療新靶點的雙重潛力［6］。

國內外有多項研究表明［7-11］，PEG10表達與PHC性別、年齡、分化程度、疾病分期等因素相關。Bang等［12］納入了218例PHC術后患者進行隨訪，發(fā)現PEG陽性是生存時間的獨立危險因素（HR=2.041）。本組病例中PEG陽性表達與女性、晚期病例、術前AFP＞200ng/mL、微血管侵犯、低分化肝癌相關，而且PEG10是PHC術后早期復發(fā)的獨立預測因素，PEG10的表達強度與中位生存期呈明顯的負相關，PEG10表達用于早期復發(fā)和生存時間的預測具有可行性。血清AFP是臨床最常用的PHC診斷和檢測工具，也是判斷預后和檢測復發(fā)的重要指標，Cucchetti等［13］認為AFP＞60ng/mL是肝癌根治術后復發(fā)的高危因素，但由于AFP在肝炎、肝硬化等疾病中也有升高，且有一定的假陽性率，而且PHC患者中只有60％～70％的患者會出現AFP升高，對于腫瘤體積較小的患者陽性率更低至33％～65％。同時AFP的預測效能與濃度相關，當術后AFP≤20ng/mL時，目前尚無有效的生物學指標進行療效檢測，Bang［12］的研究表明，在AFP≤20ng/mL時，PEG10依然與復發(fā)率明顯相關。因此對于AFP陰性的患者，PEG10將可成為有效的檢測指標。

值得注意的是，本研究中PEG陰性的患者仍有3例出現早期復發(fā)，8例晚期復發(fā)，PEG10診斷效能總體偏低（特異度77.5％、敏感度38.9％、準確性65.5％），原因除了與本研究樣本量偏少外，影響PHC預后的因素很多，單獨某一個因素的預測價值通常不高。吳鳳霞［14］對AFP、CK19、PEG10、IQGAP1進行聯合檢測分析發(fā)現，單項檢測血清腫瘤標志物可能會出現漏診，聯合兩個或多個標志物檢測可能會彌補這個缺點。

綜上所述，PEG10在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起調控作用，其表達強度可以反映腫瘤的分化程度及腫瘤的侵襲性，對PHC預后具有很高的評估價值，但是其特異性高而敏感性不高，所以不能獨立使用，需要聯合其他指標作出綜合評價。

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12 Bang H，Ha SY，Hwang SH，et al.Expression of PEG10 Is Associated with Poor Survival and Tumor Recurrence in Hepatocellular Carcinoma.Cancer Res Treat，2015，Feb 13 （Epub ohead of print）.

13 Cucchetti A1，Piscaglia F，Caturelli E，et al.Comparison of recurrence of hepatocellular carcinoma after resection in patients with cirrhosis to its occurrence in a surveilled cirrhotic population.Ann Surg Oncol，2009，16：413-422.

14 吳鳳霞.血清腫瘤標志物AFP、CK19、PEG10和IQGAP1在肝癌中表達的研究.河南大學，2014.

The correlation analysis between expression of PEG10 and prognosis of primary hepatic carcinoma

ZHANG Hai，HU Ya-hua，ZHU Yan-li，CHANGCheng，LI Dan，YU Li-qun.Ceatral Hospital of Huangshi，Huangshi 435000，China

Objective To detect the expression of PEG10 in primary hepatic carcinoma（PHC）tissues，to explore its relationship between clinical pathological parameters and prognosis of PHC.Methods The expression of PEG10 was detected by immunohistochemical（SP method）in 58 carcinoma tissues of PHC patients in our hospital.The relationship between PEG10 and clinical pathological characteristics or prognosis of PHC was analyzed.Results Among 58 specimens，44 were tested positive for PEG10，including 16 of＂+＂，13 of＂++＂and 15 of＂+++＂.The average follow-up was 40.5 months，and 23 cases（39.7％）dead by the end of follow-up.The median survival time was 31 months for all cases.And 57 months，34months，27months，15months for PEG10＂-＂，＂+＂，＂+ +＂，＂+ + +＂groups，respectively.The survival rate in different groups had significant differences（P=0.000）.Levels of PEG10 in the female，advanced tumor，preoperative alpha fetal protein（AFP）＞200ng/mL，microvascular invasion and poorly differentiated tumors cases were higher（P＜0.05），while had no relation with age，tumor diameter or etiology（P＞0.05）.Among early recurrent cases，ratio of PEG10-positive was higher than that of PEG10-negative（P＜0.05），however，which showed no significant difference in late recurrent groups（P＞0.05）.The specificity，sensitivity and accuracy rate of PEG10 in prediction of PHC recurrence was 77.5％，38.9％ and 65.5％，respectively.AJCC stage，microvascular invasion，etiology and PEG10 expression were risk factors for PHC recurrence by multivariate COX analysis（P＜0.05），in which PEG10 positive HR was 6.724.Conclusion PEG10 can effectively predict the prognosis of PHC with a high specificity but low sensitivity，which should be conjunct with other indicators to make a comprehensive evaluation.

PEG10；Primary hepatic carcinoma；Recurrence

2015-03-24）

（本文編輯：賴榮陶）

2013-2014年度湖北省衛(wèi)生廳科研指導性項目（JX6C-48）

435000 湖北黃石 湖北理工學院附屬黃石中心醫(yī)院消化內科（張海，胡亞華，朱艷莉，常城，余力群），科教科（李丹）通信作者：胡亞華，Email：33575296@qq.com