影響骨髓間充質干細胞移植治療乙型肝炎肝硬化患者近期預后因素分析

鄭聯坵 潘興南

·論 著·

影響骨髓間充質干細胞移植治療乙型肝炎肝硬化患者近期預后因素分析

鄭聯坵 潘興南

目的 了解影響骨髓間充質干細胞（BM-MSC）移植治療乙型肝炎肝硬化（HBV-LC）患者的預后因素。方法HBV-LC患者158例，根據終末期肝病模型（MELD）評分、年齡、性別進行1∶1配對，將患者分為治療組79例，對照組79例。治療組在抗病毒、保肝等基礎治療上行BM-MSC移植術，對照組僅給予抗病毒、保肝等治療。記錄治療組術前并發癥、生化、凝血功能等指標，隨訪3年。結果 治療組的患者中存活與死亡亞組上消化道出血和肝腎綜合征發生率差異有統計學意義（χ2分別為9.278和8.365，均P＜0.05），但自發性腹膜炎無明顯差異（χ2=0.633，P＞0.05）。治療組的Child-Pugh評分（CPS）B級和C級的3年生存率與對照組相比差異均有統計學意義，進一步分析發現CPS為B級的患者生存率優于C級。治療組術后死亡與否的單因素分析發現TBil、MELD評分、國際標準化比值（INR）、肌酐（Cr）差異顯著，作多因素Logistic回歸和ROC曲線分析發現，血清白蛋白低于23.4 g/L、MLED評分高于18.37分、TBil高于96.4μmol/L和INR高于1.97為治療組患者死亡的高危因素。結論 BM-MSC移植能夠提高HBV-LC患者3年生存率，術前合并上消化道出血和肝腎綜合征及低Alb和高TBil、MELD評分、INR為BM-MSC移植術后死亡的高危因素。

骨髓間充質干細胞；乙型肝炎肝硬化；預后；生存期

乙型肝炎肝硬化（HBV-LC）主要表現為肝功能損傷和門脈高壓［1］。許多HBV-LC患者因一個或多個并發癥而死亡［2］，如上消化道出血、肝性腦病、肝腎綜合征、自發性腹膜炎等。由于移植的肝源短缺、費用昂貴和潛在的嚴重并發癥使得肝移植的推廣受到嚴重的限制［3-5］。

自從1999年Petersen等［6，7］研究報道肝細胞有骨髓源性后，骨髓間充質干細胞（BM-MSC）可向肝細胞分化的研究成為生命科學研究的熱點。國內外學者的研究結果顯示，BM-MSC對肝硬化治療的療效不盡相同。一些學者報道BM-MSC移植在動物模型中證實其能夠改善肝臟纖維化，逆轉急性肝衰竭［8-11］。臨床研究也證實了BM-MSC移植能夠迅速改善肝功能，BM-MSC治療失代償性肝硬化能夠減少腹水及改善乏力等癥狀，提高患者生存率，且BM-MSC可通過減輕肝臟纖維化從而減少進展為肝癌的風險［12-17］。但也有研究發現，應用BM-MSC移植治療肝硬化未能提高患者肝功能和生存率，甚至可增加肝纖維化甚至肝癌的風險［18，19］。分析以上研究發現，因選擇的病種、病情及治療時機等不盡相同，這些可能是影響BM-MSC移植術后療效不同的混雜因素。本研究探討BM-MSC移植治療HBV-LC患者死亡的高危影響因素，為臨床上BM-MSC移植治療HBV-LC患者提供參考。

資料和方法

一、病例選擇

2007年至2010年在解放軍第一八○醫院肝病中心住院的HBV-LC患者158例，所有患者診斷均符合《慢性乙型肝炎防治指南（2010年）》標準，同時排除肝功能衰竭、其他原因導致肝硬化及影像學證實發展至肝癌階段的患者。按照終末期肝病模型（MELD）評分、年齡、性別等進行1∶1配對，將158例患者分為治療組和對照組，每組79例。治療組給予抗病毒、保肝等基礎治療的基礎上行BM-MSC移植術，對照組僅給予抗病毒、保肝等基礎治療。本項目已通過醫院器官移植倫理委員會審查批準，并在上級衛生部門備案。所有治療患者在知情同意的情況下，均已簽定知情同意書。

二、BMSC的采集

在層流無菌治療室內，選患者雙側髂后上棘為骨髓采集點，常規消毒鋪巾局部浸潤麻醉后，用18號骨髓穿刺針穿刺，骨髓量為（84.5±11.3）mL，用4000 U肝素抗凝，采集過程中避免污染。

三、BM-MSC的分離及確認

將患者骨髓離心，然后去除脂肪層，用等量DMEM培養液稀釋穿刺抽取的骨髓液，制成細胞懸液［18］。將骨髓輕輕加到密度1.073 g/mL的percoll分離液上，1200×g，25 min（室溫下）。吸取界面細胞層，用0.9％氯化鈉溶液洗脫，1500×g，5 min離心共3次。用0.9％氯化鈉溶液重懸細胞，并留取少量細胞培養5 d和8 d，通過顯微鏡下觀察細胞形態（圖1）生長良好，并計數所得BM-MSC大于1.0×107/mL，將其放置37℃的二氧化碳孵箱待用。

四、BM-MSC的移植

在介入治療室DSA下，采用Seldinger技術行股動脈穿刺肝動脈插管術，將分離待用的BM-MSC，在DSA造影確認未見肝內腫瘤后，經肝動脈導管緩慢注入肝內，最后用20 mL 0.9％氯化鈉溶液沖洗管腔。

五、隨訪

記錄患者BM-MSC移植前并發癥情況、生化、凝血功能、Child-Pugh評分（CPS）及MELD評分等，隨訪3年。

圖1 骨髓間充質干細胞的形態

六、統計學方法

所有資料均采用SPSS 16.0軟件進行統計分析，Prism 5.0軟件進行作圖。按CPS不同等級采用Kaplan-Meier法進行生存分析，通過對移植前計數資料進行單因素分析并做顯著性檢驗（P＜0.05），然后對差異有統計學意義的因素進行多因素Logistic回歸，最后繪出ROC曲線，按AUC＞70％為有意義［20］，計算出各指標的臨界值。

結果

一、臨床資料基本情況

納入的患者均為HBV-LC，其中治療組年齡為（47.4±12.3）歲，男女性別比例為8.4∶1，對照組年齡（46.9±13.1）歲，性別比例與治療組相同。BMMSC移植前患者并發癥分布情況為自發性腹膜炎16例次（20.3％），上消化道出血（UGH）14例次（17.7％），肝腎綜合征（HRS）3例次（15.8％）。

二、HBV-LC患者并發癥對BM-MSC移植術后的影響

治療組79例患者隨訪3年，失訪3例，存活47例，死亡29例。對存活和死亡患者的術前并發癥進行分析（見圖2），結果移植前患者的UGH及HRS發生率兩組差異有統計學意義（χ2分別為9.278和8.365，均P＜0.05），說明UGH和HRS可能為HBVLC患者BM-MSC移植術后死亡的高危因素，而SBP兩組差異無統計學意義（χ2=0.633，P＞0.05）。

圖2 肝硬化患者并發癥對BM-MSC移植術后預后的影響

三、BM-MSC移植治療HBV-LC患者的生存分析

治療組與對照組均隨訪3年，治療組失訪3例，對照組失訪5例，兩組失訪率分別為3.8％和6.3％（均小于20％），提示結果較為可靠。將治療組與對照組患者分為CPS評分B級和CPS評分C級兩亞組，通過生存分析可知（見圖3），CPS評分為B級和C級與對照組的3年生存率相比均差異有統計學意義（χ2= 4.036，P=0.049；χ2=4.434，P=0.039），進一步分析治療組中的CPS評分為B級的3年生存率與C級相比差異有統計學意義（P=0.027）。說明治療組能夠提高患者的3年生存率，并且CPS評分為B的生存率優于C級的患者。

圖3 治療組與對照組不同CPS評分等級的3年生存曲線

四、影響BM-MSC移植治療HBV-LC患者預后的因素

將治療組移植前的各項指標按存活和死亡進行單因素分析并做顯著性檢驗（見表1），通過單因素分析得到影響BM-MSC移植術后3年內死亡與否的主要相關因素有Alb、TBil、MELD評分、CR及INR，將以上指標作Logistic回歸分析，發現低Alb、高TBil、CR、MELD、INR均為移植后患者死亡的高危因素。將以上指標進行ROC分析，取AUC＞0.70為有意義指標，并計算出各危險因素的臨界值（見表2），提示患者術前Alb低于23.4 g/L、MLED評分高于18.37分、總膽紅素高于96.4μmol/L和INR高于1.97為BM-MSC移植術后患者死亡的高危因素。

表1 生存組與死亡組的影響因素單因素分析

表2 BM-MSC移植治療HBV-LC患者死亡高危因素的臨界值

討論

骨髓中富含間充質干細胞，BM-MSC是一類具有多向分化潛能的均質性細胞，目前許多研究表明它可誘導分化為成熟的肝細胞或膽管細胞，而且肝細胞生長因子（HGF）等細胞因子［21］或微環境［22］對干細胞的定向分化起重要作用。基于此，國內外學者做了大量的基礎實驗與臨床研究，但得出的結論也不盡相同。國內學者Li等［8］的動物試驗研究采用急性肝衰竭的豬模型發現，BM-MSC移植能夠提高急性肝衰竭的遠期生存率。Peng等［13］的BM-MSC治療肝硬化患者的臨床研究提出BM-MSC移植能夠短期提高患者的肝功能，但36個月后兩者差異無統計學意義，隨訪192周兩組肝癌的發生率和生存率無明顯差異，而Amer等［12］的研究報道了BM-MSC移植能夠改善肝硬化患者的乏力癥狀，減輕腹水量，提高患者的生存率。近期Pan等［23］的一項meta分析共納入了5篇文章，分別來自于中國、伊朗、巴西、埃及等國家的研究發現BM-MSC能夠在1年內改善患者的肝功能及減輕乏力等癥狀，并提出影響BM-MSC治療肝硬化患者近期預后的影響因素可能為移植前患者的病情、MELD評分及治療前患者生化、凝血功能等。

本研究發現，BM-MSC移植前的并發癥對預后有影響，術前并發UGH和HRS的患者為移植術后死亡的高危因素，這可能由于肝硬化后肝臟的血液供應差，肝血竇狹窄、毛細血管化嚴重導致門脈壓力高，導致UGH，而BM-MSC移植只是改善肝臟實質細胞，無法改變患者門脈高壓狀態［23］。而并發癥HRS可能由于隨著肝硬化程度的加重，門靜脈血流阻力增加，血管舒張因子合成增多，同時由于肝內分流和側支循環，血管舒張因子由內臟血流釋放至體循環，使體循環血管阻力進一步下降，引起體循環功能異常。在動脈循環極度充盈不足的情況下，機體通過激活交感神經系統、腎素-血管緊張素系統和抗利尿激素系統維持動脈血壓，雖然此作用有助于維持有效血容量和血壓，但嚴重影響腎功能，導致腹水、水腫以及高容量低鈉血癥，使腎血流量減少，腎小球濾過率下降，誘發各種腎內縮血管物質增加，進一步惡化腎功能所致［24］。國外一項多中心臨床研究對263例肝硬化伴腹水患者隨訪41個月，結果顯示HRS發生率為7.6％，患者生存期為2周至6個月［25］，而本研究中合并HRS患者生存期為12～14個月，提示BM-MSC可能可以提高HBV-LC合并HRS的患者生存期，但遠期預后差。而SBP對BM-MSC移植預后的影響不明顯，這可能與近年來對SBP治療及時和通過腹水培養使用敏感的抗生素治療相關。將治療組與對照組按CPS分為B級和C級亞組，通過3年的生存分析可見，治療組可以提高患者的生存率，對于CPS評分為C級患者提高生存率的差異顯著，而CPS為B級提示治療組也能提高患者的生存率（χ2=4.036，P=0.049），但分析數據發現CPS為B級亞組的患者例數較少，且P值接近于0.05，故在一定程度影響了結果的可靠信。進一步研究發現治療組的CPS評分為B級的3年生存率優于C級。但對治療組作單因素分析結果提示，移植后死亡與CPS評分無明顯差異，分析治療前患者CPS數據可知，納入治療組的患者CPS評分為8分至13分，且大部分CPS分值集中于10分左右，考慮與此有關。

將影響BM-MSC移植術后患者死亡因素進行單因素分析發現，TBil、Cr、INR、MELD評分這4個評價指標的P＜0.05，而血清Alb的P值接近于0.05將以上幾個指標作多因素Logistic回歸發現，低Alb和高TBil、Cr、MELD、INR均為移植術后患者死亡的高危因素。為明確臨界值，我們采用ROC曲線對以上數據進行分析，取AUC＞0.70為有意義［20］得出臨界值，提示HBV-LC患者血Alb低于23.4g/L、MLED評分高于18.37分、TBil高于96.4μmol/L和INR高于1.97，行BM-MSC移植治療預后死亡風險高。

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（本文編輯：賴榮陶）

“ECHO臨床病例征集項目”通知

為提高對肝硬化導致的高血氨癥及肝性腦病的臨床診療水平，從而改善對肝硬化患者的管理，上海市感染性疾病科臨床質量控制中心和《肝臟》雜志社與衛材（中國）藥業有限公司合作設立“ECHO臨床病例征集項目”，病例征集范圍為肝性腦病（輕微型肝性腦病/顯性肝性腦病）或肝源性高血氨癥患者，旨在進一步推進肝功能衰竭及肝硬化治療的發展，為中青年醫師提供學術交流的機會。

本項目從9月1日開始進行相關病例征集（病例制作為PPT格式）；11月30日病例征集截止。由評委團初評12位參賽選手，進入12月上旬在上海舉行的ECHO病例征集演講比賽。最終評選出一等獎1名，二等獎2名，三等獎3名。冠軍選手將獲得2016年AASLD或類似海外會議全程贊助。

參賽病例發送至《肝臟》雜志社官網http：//hepatoday.org。我們誠摯邀請您的參與，并給予寶貴意見和建議。

上海市感染性疾病科臨床質量控制中心

《肝臟》雜志社

衛材（中國）藥業有限公司

2015年8月

Study on the influencing factors of short-term prognosis in HBV-related cirrhosis patients treated with bone marrow mesenchymal stem cells transplantation

ZHENG Lian-qiu，PAN Xing-nan.Clinical Liver Center，180thHospital of People’s Liberation Army，Quanzhou 362000，China

Objective To investigate the prognostic factors for hepatitis B liver cirrhosis（HBV-LC）patients treated with bone marrow-derived mesenchymal stem cells（BM-MSC）transplantation.Methods Seventy-nine patients with HBVLC were enrolled as treatment group to accept BM-MSC transplantation combined with anti-viral and liver protection therapy，while control group only received anti-viral and liver protection therapy.Then treatment and control group were matched 1∶1 on the bases of the model for end-stage liver diseases（MELD）score，age and gender.Complications，biochemistry and coagulation function in treatment group were recorded before and after transplantation，follow-up of which was conducted for 3 years.Results The incidences of preoperative complications of upper gastrointestinal hemorrhage （UGH）and hepatorenal syndrome（HRS）were significantly different between the subgroups of survival and death in treatment group （χ2were 9.278 and 8.365，respectively，P＜0.05），while the incidence of spontaneous bacterial peritonitis in the two subgroups was not significantly different（χ2=0.633，P＞0.05）.Compared with control group，the 3-year survival rate of patients evaluated as Child-Pugh class B and C in treatment group was significantly different.In addition，further research showed that class B subgroup had a higher 3-year survival rate than class C group.The differences of total bilirubin（TBil），MELD score，international normalized ratio（INR）and creatinine（Cr）were significant between the subgroups of survival and death in treatment group.Then these indicators were analyzed with logistic regression analysis and receiver operating characteristic curve analysis，which showed that cases with serum albumin lower than 23.4 g/L，MELD score higher than 18.37，TBil higher than 96.4μmol/L and INR higher than 1.97 had a high risk of death.Conclusion BM-MSC transplantation in treatment of HBV-LC can improve the 3-year survival rate.Preoperative UGH and HRS complications，low serum albumin（Alb）level，and high levels of MELD score，TBil and INR carry high risk of death after BM-MSC transplantation.

Bone marrow-derived mesenchymal stem cells；Hepatitis B liver cirrhosis；Prognosis；Survival rate

2015-02-13）

南京軍區醫藥衛生重點基金課題（07Z021）

362000 福建泉州 解放軍第一八○醫院肝病中心

潘興南，Email：xnpancn@163.com