糞便K-ras12基因突變和血清CA19-9 CEA聯合檢測在胰腺癌早期診斷中的價值

滕衛軍　朱以軍　陳燕萍　施昕　厲學民

糞便K-ras12基因突變和血清CA19-9 CEA聯合檢測在胰腺癌早期診斷中的價值

滕衛軍朱以軍陳燕萍施昕厲學民

目的 評價糞便K-ras12基因突變和血清CA19-9、CEA聯合檢測在胰腺癌早期診斷中的價值。方法 對2006年7月到2010年6月38例胰腺癌患者（早期8例、中晚期30例）和175例胰腺良性疾病患者的糞便K-ras12基因突變和血清CA19-9、CEA的陽性率進行比較和分析。結果 胰腺癌組糞便K-ras12基因突變和血清CA19-9、CEA的陽性率顯著高于胰腺良性疾病組；早期胰腺癌組糞便K-ras12基因突變陽性率顯著高于良性疾病組，而血清CA19-9、CEA的陽性率與良性疾病組比較無顯著差異；中晚期胰腺癌組糞便K-ras12基因突變陽性率顯著高于早期胰腺癌組，而血清CA19-9、CEA的陽性率與早期胰腺癌組比較無顯著差異。糞便K-ras12基因突變、血清CA19-9、CEA診斷早期胰腺癌的敏感性分別為50%、37.5%、37.5%，特異性分別為89.7%、77.1%81.1%。用平行法聯合檢測糞便K-ras12基因突變和血清CA19-9、CEA診斷早期胰腺癌的敏感性為87.5%、特異性74.2%；用系列法聯合檢測糞便K-ras基因突變和血清CA19-9、CEA診斷早期胰腺癌的敏感性為25%、特異性為94.9%。結論 糞便K-ras12基因突變和血清CA19-9、CEA的聯合檢測可顯著提高診斷早期胰腺癌的敏感性和特異性。

胰腺腫瘤 K-ras12基因 腫瘤標志物

胰腺癌的發病率在同內外均逐年升高，但由于解剖位置關系以及缺乏特異有效的檢查手段，胰腺癌的早期診斷仍相當困難［1］，血清腫瘤標志物及相關腫瘤基因及蛋白表達的檢測為此提供了可能。其中，CA-199、K-ras12基因突變檢測被認為對胰腺癌的診斷有很高價值，但是單一的檢測結果并不理想。有研究發現將上述指標進行聯合檢測可以彌補單一檢測的不足，并可將診斷率提高到90%以上［2、3］。本文旨在探討糞便K-ras基因第12位密碼子突變和CA-199、CEA聯合檢測在胰腺癌早期診斷中的作用。

1　臨床資料

1.1一般資料 選擇2010年7月至2014年6月在本院住院的進展期胰腺癌患者30例（男女各15例，年齡45～83歲），早期胰腺癌患者8例，所有胰腺癌患者均經手術、病理或明確的影像學檢查證實。胰腺良性疾病患者175例（男98例、女77例，年齡32～82歲）。1.2 方法 （1）標本的采集和RNA抽提：糞便DNA提取采用DNA抽提試劑盒步驟如下：取患者糞便5g溶于5ml 0.9%生理鹽水中，予離心機分離后取上清液1ml，加入等體積的DNA抽提。混勻后振蕩、萃取、離心后，上清用醋酸氨和無水乙醇沉淀，干燥，雙蒸水溶解保存。（2）檢測K-ras12密碼子突變：采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）法。PCR-RFLP實驗操作過程為2次PCR及2次酶切。第1輪PCR反應：PCR反應體系包括10×ExTaq緩沖液5μl，dNTP混合液4μl，P10.5μl，P20.5μl，模板DNA≤1Ul，用無菌雙蒸水定容至50μl，PCR反應條件：97℃預變性30s，52℃退火30s，72℃延伸45s共30個循環，72℃延伸5min。第1輪酶切：取PCR產物5μl，限制性內切酶MvaI 1 Ul（10U/μl），37℃酶切1h；第2輪PCR反應：取酶切產物5 uL，反應體系及條件同第1次PCR反應，僅引物換為P1和P3。第2輪酶切：取PCR產物5μl，限制性內切酶MvaI 1μl（10U/ μl），37℃酶切1h。取第2輪酶切產物進行2%瓊脂糖電泳后觀察結果。（3）CA-199、CEA檢測：全部患者于術前抽取靜脈血，經發光免疫法測定，健康人的參考值分別為CA-199＜37U/mL，CEA＜5ng/ml。

1.3統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。各組血清CA19-9、CEA、糞便K-ras12基因突變檢出率的比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1胰腺良性疾病組和胰腺癌組患者糞便K-ras12基因突變率及血清CA19-9、CEA的比較 見表1。

表1　各組患者糞便K-ras12基因突變率及血清CA19-9、CEA陽性率的比較［n（%）］

2.2糞便K-ras12基因突變率及血清CA19-9、CEA對早期胰腺癌診斷效果比較 見表2。

表2　糞便K-ras12基因突變率及血清CA19-9、CEA對早期胰腺癌診斷效果的比較（%）

3　討論

早期的胰腺癌無典型癥狀，常被誤診，而使85%的患者喪失了手術機會，因此胰腺癌的早期診斷是直接影響胰腺癌患者預后的主要因素。胰腺癌的發生也是一個多階段的復雜過程，從致癌因素作用于正常細胞到形成臨床上可檢測的腫瘤常需要經過很長的潛伏期，亦提示一個正常細胞轉化為惡性表型之前必須經歷多種變化。但Ras蛋白作為一種細胞信號因子，在胰腺癌發生發展中與細胞增殖之間的關系尚不清楚。流行病學研究發現，胰腺癌發生與慢性胰腺炎病程呈正相關。若認為胰腺癌發生是一個漸進過程，K-ras突變必定存在于癌前的增生性病變和癌組織中，而基因突變致基因表達水平的改變是細胞癌變的早期事件。因此有人認為K-ras突變是腫瘤發生的早期環節，與腫瘤分期無關。K-ras基因突變在胰腺癌中具有高表達，現已檢測出胰腺癌患者的組織、胰液、糞便和血液的K-ras基因突變。其中組織中K-ras基因突變的陽性率最高達100%［4］。其次為胰液，陽性率＞80%［5～7］，但上述方法大多具有創傷性而難以廣泛開展，另外，很多患者由于不能耐受ERCP和組織學檢查而失去診斷機會。糞便K-ras基因突變的檢測 以其簡便、可重復性強、無創傷等優點，彌補了組織和胰液K-ras基因突變檢測的不足。本資料結果顯示8例早期胰腺癌患者中4例檢出k-ras12基因突變，敏感性50%，特異性89.7%；30例中晚期胰腺癌患者中26例檢出k-ras12基因突變，敏感性86.7%，特異性89.7%。良性組K-ras12基因突變率顯著低于早期胰腺癌組，提示K-ras12基因在早期胰腺癌即有顯著升高。但本資料亦發現早期胰腺癌組K-ras12基因突變率顯著低于晚期胰腺癌組（P＜0.01），與Yamahita等［7］研究不相符，可能與本研究中早期胰腺癌樣本過少有關。

CA19-9、CEA是兩種較好的血清腫瘤標志物，目前已廣泛用于胰腺癌的篩查，它由人的胰腺、膽管細胞及胃、結腸等處的上皮細胞合成，因此對于消化系統的腫瘤CA19-9、CEA均會有增高，只是血清水平不同而己。本資料對CA19-9、CEA的檢測中發現良性組CA19-9、CEA檢出率均顯著低于胰腺癌組。且早期胰腺癌組CA19-9檢出率及數值顯著低于晚期胰腺癌組，提示CA19-9、CEA對胰腺癌均有較強的敏感性。但CA19-9、CEA升高也可見于胃癌、結腸癌、膽囊癌、膽管癌等疾病，因此作者認為CA19-9、CEA對消化系統的腫瘤有篩選的作用，它的敏感性尚可，但是特異性不高。

有學者報道，應用腫瘤標記物聯合癌基因檢測的方法有較高的特異性和敏感性。本資料采用K-ras12基因和CA-199、CEA聯合檢測的方法彌補單一檢測的不足。結果證明，平行試驗聯合檢測（即三者中有一為陽性）可提高敏感度到87.5%，特異度為74.2%。應用系列試驗聯合檢測（即三者皆為陽性）敏感度降為25%，特異度上升為94.9%。當做平行聯合檢測時，可提高胰腺癌診斷的敏感性和陰性預測值，減少漏診的概率，由于特異性較差，此法較適用于門診患者的篩選。而系列聯合檢測則可提高診斷的特異度和陽性預測值，提高診斷的準確性。

1 陸星華.胰腺癌研究現狀與展望.胰腺病學,2003,3（2）：63～65.

2 Futakawa N,Kimum W,Yamagata S,et a1.Significance of K-ras mutation and CEA level in pancreatic iuice in the diagnosis ofpancreatic cancer.J Hepatobiliary Pancreat Surg,2000,7（1）：63～71.

3 Myung SJ,Kim MH,Kim Y,et a1.Telomemse activity in pure pancreatic juice for the diagnosis of pancreatic cancer may be complementary to K-ras mutation.Gastrointesti Endosc,2000,51（6）：708～713.

4 Tada M,Omta M,Ohta M,et al.Clinical application of ras gene mutation for diagnosis of pancreatic adenocarcinoma.Gastroenterolo gy,1991,100（1）：233～238.

5 Kmnra W,zhao B,Funtakana N,et al.Signifcance of k-ras codon 12 point mutation in pancreatic juice in the diagnosis of carcinoma of the pancreas. Hepatogastroenterology,1999,46（25）： 532～539.

6 Kaino M.Kondoh S，Okita S.et al.Detection of K-ras and p53 gene mutations in pancreatic juice for the diagnosis of intraductal papillary mucinous tumors.Pancreas 1999,l8：294～299.

7 Yamahita K,Kida Y,Shinoda H,et al .K-ras point mutations in the supernatants of pancreatic Juice and bile are reliable for diagnosis of panacreas and biliary and tract carcinomas complementary to cytologic Examination. Jpn J Cancer Res, 1999,90（2）：240～248.

Objective Abstract Objective To explore the value of combining the test of gene mutation of K-ras12 in stool samples and serum CA 199 and CEA for the early diagnosis of pancreatic cancer. Methods The gene mutation of K-ras12 in stool samples and elevated serum level of CA 199 and CEA of 38 cases of pancreatic cancer(8 cases of early stage, 30 cases of middle and late stage) and of 175 cases with pancreatic benign diseases from July, 2006 to June, 2010 were compared and analyzed. Results The gene mutation of K-ras12 in stool samples were signifi cantly higher in the early stage of pancreatic cancer, while the rate of elevated serum level of CA 199 and CEA was not signifi cantly different from the benign group; in the middle and late stage of pancreatic cancer, the gene mutation of K-ras12 in stool samples were signifi cantly higher while the rate of elevated serum level of CA 199 and CEA was not signifi cantly different from the benign group. The sensitivity rates of gene mutation of K-ras12 in stool samples and the elevated serum level of CA 199 and CEA in the diagnosis of early pancreatic cancer were 50%、37.5%、37.5%，with the specifi city of 89.7%、77.1% and 81.1%, respectively. Combined test with paralleled method for the detection of gene mutation of K-ras12 in stool samples and the elevated serum level of CA 199 and CEA has the sensitivity rate of 25% and the specifi city rate of 97.6%. Conclusions Combined test with paralleled method for the detection of gene mutation of K-ras12 in stool samples and the elevated serum level of CA 199 and CEA can signifi cantly increase the sensitivity rate and the specifi city rate for early pancreatic cancer.

Pancreatic tumor K-ras 12 gene Tumor marker

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